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＜博士論文＞
カイコにおけるポリコーム複合体の機能解析
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| 論文調査委員 | |
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| 学位授与大学 | |
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| 概要 | Polycomb group (PcG)タンパク質複合体は、多くの動植物種においてクロマチン修飾を介した遺伝子発現の抑制の役割を担っており、細胞周期、X染色体の不活化、ゲノムインプリンティングなどを発生プログラムの進行に従って制御している。発生過程におけるポリコーム複合体の制御機構はある程度理解されているが、ゲノム工学の急速な発展に伴う大規模解析技術の発展により生み出される情報は、より複雑で、多様...性に富んだポリコーム複合体の制御機構の存在を示唆している。そこで、本研究では、モデル昆虫であるカイコBombyx moriのポリコーム複合体の機能とその制御機構の解析を行った。まず、ショウジョウバエで報告されているポリコーム複合体関連遺伝子の情報を基にカイコゲノムデータベースより、13 遺伝子を単離・同定した。他の昆虫種との比較解析により、ポリコーム複合体関連遺伝子はカイコを含む昆虫種で保存されていることを明らかにした。また、これらの遺伝子がコードするタンパク質が、核に局在すること、プロモーター近傍への結合によりレポーター遺伝子の発現を抑制することなどから、機能的なホモログであることが強く示唆された。さらに、ポリコーム複合体中のPRC2 構成因子である BmE(Z)、BmESC、BmSU(Z)12 のRNAiによる遺伝子発現阻害によって、カイコゲノム中のグローバルなヒストンH3リジン27（H3K27）のトリメチル化が低下したことから、 カイコにおいてもPRC2がH3K27のトリメチル化活性を担っていることを示した。次に、カイコポリコーム複合体の標的遺伝子を網羅的に同定するために、４つのポリコーム複合体関連遺伝子BmSCE、BmESC、BmPHO、BmSCMをRNAiにより機能阻害し、mRNA発現プロファイルの変化をマイクロアレイにより解析した。その結果、４遺伝子の阻害により共通して発現が上昇した遺伝子は、29個と少なかったが、BmPHOとBmSCMの阻害により共通して発現が上昇した遺伝子は331個あったことから、これらの２遺伝子はポリコーム複合体と独立に機能できる可能性があることが示された。BmPho は、そのC-末端Zincフィンガー領域を介してBmScm と直接相互作用しており、BmPho 非存在下では、BmScm は核局在できなかった。これらの結果より、BmPhoが結合領域を認識し、BmScmをリクルートすることで、全ポリコーム複合体をアセンブルすることなく、遺伝子発現を抑制できることを明らかにした。最後にカイコゲノム上の特定遺伝子について、ポリコーム複合体の制御機構を解析した。標的遺伝子には、マイクロアレイ解析で同定した29遺伝子の１つasparagine synthetase (BmASNS) を選定した。RNAiによる遺伝子阻害と変異型プロモーターを用いた詳細な解析により、BmASNSプロモーター上でポリコーム複合体は種々の転写因子と拮抗していることが明らかになった。特に、BmASNSプロモーター上では上流域のCpG island に近接したYY1（PHO）結合領域が重要であること、この領域のH3K27はカイコポリコーム複合体によりトリメチル化されるが、DNAメチル化は必ずしも必要ないこと、また、この領域を中心に転写活性化因子C/ebp と競合できることを明らかにした。さらに、このポリコーム複合体とC/ebp の競合は、細胞周期に依存しており、G1-S期はC/ebp による転写活性化、G2-M期にはポリコーム複合体による転写抑制が強く機能していることを明らかにした。以上の結果より、カイコには少なくとも13個のポリコーム複合体関連遺伝子が保存されており、H3K27のトリメチル化を介したクロマチン制御を行っていることを明らかにした。一方、BmPhoとBmScmは全ポリコーム複合体をアセンブルすることなく、遺伝子発現を抑制できることを明らかにした。さらに、ポリコーム複合体による遺伝子発現制御は、他の転写因子との複雑な相互作用により成り立っており、その力関係は細胞系譜や細胞周期によっても左右されることを明らかにした。 Polycomb group (PcG) proteins are involved in chromatin modifications for maintaining gene repression that play important roles in the regulation of cell cycle progression, tumorigenesis, chromosome X-inactivation, and genomic imprinting in D. melanogaster, mammals, and even plants. Although the regulatory mechanisms of PcG complexes have been well understood right now, the emerging evidence have shown much more complicated and varied ways in different species. Therefore, the aim of this work is studied to understand the action mechanism of PcG system in the model insect B. mori. In Chapter I, based on the updated silkworm genome sequence, a genome-wide identification of the B. mori PcG genes were performed by using the D. melanogaster PcG genes as queries. As a result, 13 PcG genes were identified in the silkworm genome. Comparison of the B. mori PcG proteins with those from other insect species was also analyzed and revealed a conserved evolution of the insect PcG proteins. In order to determine that the identified B. mori PcG genes act as PcG functions, several PcG genes with the complete open reading frame (ORF) were isolated and their subcellular localization in the silkworm cells as well as the transcriptional repression on the report system were also investigated. Moreover, knocking down of the PRC2 components BmE(Z), BmESC, and BmSU(Z)12 by RNA interference (RNAi), considerably decreased the global levels of H3K27me3, indicating the contribution of the B. mori PRC2 complex on the tri-methylation of H3K27. In order to characterize the potential target genes regulated by the B. mori PcG proteins, in Chapter II, the genome-wide expression screening after RNAi of four PcG genes BmSCE, BmESC, BmPHO, and BmSCM, representing distinct complexes were carried out in the silkworm cells. The analysis for the up-regulated genes has revealed that the candidate target genes possess binding activity, catalytic activity, or transcription regulator activity, suggesting that B. mori PcG may play important roles in a variety of developmental processes via the regulation of its target genes. And finally, to understand the regulatory mechanism of PcG proteins in a given genome locus, in Chapter III, a specific target gene asparagine synthetase (BmASNS) identified from microarray data in Chapter II was used to further study. The present result has elucidated a novel epigenetic regulation in which PcG complexes regulate BmASNS expression involving H3K27me3. The data demonstrated that PcG proteins repress the transcription of BmASNS gene through recruiting to the putative YY1 binding motifs and CpG island within the BmASNS promoter. It is therefore tempting to speculate that the YY1 binding element, as well as the CpG island is sufficient to recruit PcG complexes and subsequently deposited H3K27me3 to repress target gene expression in B. mori. Particularly, this study provides important new insights into the mechanism underlying the dynamic regulation of its target gene by PcG system during the cell cycle. In conclusion, the present study on the identification and functional characterization of B. mori PcG complexes has revealed some novel insights into the regulation mechanisms. These findings will also provide fundamental knowledge useful for further investigations of PcG functions in B. mori.続きを見る |
| 目次 | GENERAL INTRODUCTION CHAPTER I Identification and Characterization of Polycomb Group Proteins CHAPTER II Genome-wide Analysis of Polycomb Target Genes CHAPTER III Recruiting Mechanism of Polycomb Complexes to a Target Gene GENERAL DISCUSSION REFERENCES SUPPLEMENTS ACKNOWLEDGEMENTS / |
本文ファイル
| ファイル | ファイルタイプ | サイズ | 閲覧回数 | 説明 |
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論文正文_李志清
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44.5 MB | 667 | 本文 | |
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abstract_jpn
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188 KB | 317 | 要旨（日） | |
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105 KB | 198 | 要旨（英） |
詳細
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| 学位記番号 | |
| 授与日(学位/助成/特許) | |
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| 登録日 | 2013.07.10 |
| 更新日 | 2023.12.08 |