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1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 蛋白質分解制御におけるユビキチン関連蛋白質の機能 — Function of ubiquitin-related protein in protein degradation
小林 英紀 ; KOBAYASHI Hideki
研究期間: 2002-2003
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概要: ユビキチンおよびユビキチン関連蛋白質による蛋白質修飾とその制御は、蛋白質の分解シグナル、蛋白質の品質管理とシャペロン機能、転写調節、ストレス応答などの蛋白質分解機能の調節に重要な役割を果たす。ユビキチン-プロテアソーム分解経路において、ユビキチン化システムとプロテアソームによる分解機構がよく理解されているのに比べ、ユビキチン化された分解蛋白質がどのようにして識別されプロテアソームにリクルートされるのか、そのしくみは未解明であった。本研究では、ユビキチン化分解蛋白質の識別とその配送の調節機構の解明を目的として、N末端ユビキチン関連蛋白質XDRP1/Dsk2の機能解析を行い、ポリユビキチン化した分解蛋白質をプロテアソームに運ぶアダプター因子の同定識別とプロテアソーム配送の分子機構を明らかにした。初年度(平成14年)は、UBAドメインを持つポリユビキチン結合蛋白質Dsk2を同定し、そのDsk2UBA、ドメインが分解蛋白質のポリユビキチン鎖を捕捉し、UbLドメインを介してプロテアソームに運ぶアダプター因子であることが明らかになった。次年度(平成15年)は初年度の研究成果に基づいて、Dsk2とプロテアソームの機能相関を解析した。Dsk2による生育阻止のサプレッサーの遺伝学的および分子生物学的解析を行い、ポリユビキチン化した分解蛋白質がプロテアソームの19S調節粒子のサブユニットRpn1レセプターで捕捉されて、20Sコア粒子に配送分解されることが明らかになった。また、今まで機能が分からなかったSem1がプロテアソームの19S調節粒子の新規の構成成分であることが明らかになったSem1は19S調節粒子と20Sコア粒子の会合に関与する新たな会合因子で、26Sプロテアソームの構造の安定に必要である.これらの解析により、今まで未解明であった、ポリユビキチン化分解蛋白質のプロテアソームへの配送の分子機構を明らかにした。 続きを見る
2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of AAA-ATPaseSKD1によるユビキチンシグナル依存性膜蛋白質選別機構の解明 — A study of an ubiquitylation-dependent protein sorting regulated by SKD1, an AAA-ATPAse.
藤田 英明 ; FUJITA Hideaki
研究期間: 2004-2005
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概要: 本研究はエンドソームにおける膜蛋白質のユビキチン化とそれに続く選別輸送の分子機構を明らかにすること、これまで同定したSKD1結合蛋白質について機能解析を行い、エンドソームにおけるMVBの形成および膜蛋白質選別輸送の分子機構を明らかにすることを目的として行った。 1)SKD1(E2350)過剰発現により蓄積するユビキチン化膜蛋白質の網羅的プロテオミクス解析: アデノウイルスを用いた変異型SKD1(E235Q)発現によりエンドソームに蓄積するユビキチン化蛋白質を、細胞分画およびユビキチン抗体カラムを用いたアフィニティクロマトグラフにより精製した。得られたユビキチン化蛋白質をトリプシン消化後に質量分析法(ESI-LC-MS/MS)による網羅的プロテオーム解析を行い、ユビキチン化によりその局在が制御されている膜蛋白質を少なくとも20種類同定した。さらにこの中から8種類の膜蛋白質についてユビキチン化フォームの検出(ウエスタンブロッティングでラダーとして検出)あるいは変異型SKD1(E235Q)発現依存的な局在の変化を認めた。 2)SKD1結合蛋白質SBP1・SBP3(mVPS2p/CHMP2A)の機能解析: 可溶性細胞質蛋白質であるSBP1はそのC末部分のCoiled-coilドメインを介してSKD1と相互作用すること、SKD1(E235Q)の過剰発現によりSKD1とともに巨大蛋白質複合体を形成しエンドソーム膜上へと局在することなどを報告した。またSBP1のヒトホモログlip5(lyst-interacting protein 5)はリソソームの形態異常を示すChediak-Higashi Syndromeの原因遺伝子であるlyst(lysosomal trafficking regulator)に結合することから、SKD1/SBP1が何らかの形でlystの機能発現制御を行っている可能性が高い。SKD1(E235Q)を過剰発現させた細胞で可溶性膜蛋白質であるlystが膜画分へ局在変化することを明らかにした。さらにSBP3がSKD1とESCRT-IIIの相互作用に関与していることを明らかにした。 続きを見る
3.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 細胞周期におけるサイクリンの機能制御因子 — Regulatory Factors of Cyclin Functions in the Cell Cycle
小林 英紀 ; KOBAYASHI Hideki
研究期間: 1996-1998
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概要: 本年度の研究計画に沿って、日本側九州大学小林英紀が酵母と両生類ツメガエルサイクリン結合因子の遺伝的解析を、英国癌研究所のHunt博士が両生類ツメガエルのサイクリンの生化学的解析を、ケンブリッジ大学のCarrington博士が哺乳類マウスのサイクリン結合因子の機能解析を、それぞれ3研究室間で互いに研究連絡をとりあいながら、細胞周期におけるサイクリンの構造と機能に関する研究を行った。 本年度は、小林は、2-ハイブリッド法を用いて同定したサイクリンAのN末端に結合する因子の機能解析を行った結果、ユビキチン類似配列を持った新規タンパク質がサイクリンAの分解を選択的に抑制した。そこで、この生化学的解析をツメガエルの細胞周期系を用いてHunt博士との共同実験を行った結果、本因子はサイクリンAに結合してその分解を特異的に抑制する新規因子であることを同定した。さらに、マウスのA型サイクリンの解析をおこなっているCarrington博士と共に、マウスから本因子のホモログを同定してその解析を進めた。 同時に前年度及び、本研究結果について、13回臨床研国際会議(RIC International Conference,Tokyo)において小林とT.Huntが、それぞれの研究成果を発表するとともに、国際学術誌に論文として発表した。本共同研究はそれぞれの研究室間で極めて効率的に遂行され、今後、発展的に継続することを計画中である。 続きを見る
4.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 神経変性疾患における封入体物質のユビキチン化に関わる因子の単離同定と解析 — Identification of the factors mediating ubiquitination of inclusion body in neurodegenerative diseases
中山 敬一 ; NAKAYAMA Kei-ichi
研究期間: 1999-2000
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概要: 神経変性疾患における封入体を構成している物質は、ほとんどがユビキチン化されていることが知られている。そこで私達はその物質のユビキチン化機構の詳細を調べるために、それらの物質に特異的にユビキチン化を起こす酵素の精製及び遺伝子の単離同定を試みた。まず培養細胞内で封入体形成を引き起こすことのできるポリグルタミン病をモデルシステムとして選び、ポリグルタミン病の中で我が国の研究者によって原因遺伝子が発見されたMJD1蛋白質を中心に解析を進めた。 MJD1を培養細胞内に発現させると強力にユビキチン化されることが明らかとなった。私達はその反応を組換えMJD1蛋白質をウサギ網状赤血球抽出液を適当な条件下で混合することによって、試験管内無細胞系で再現することに成功した。そこでこの無細胞系を用いて、ウサギ網状赤血球抽出液に含まれると推定されるユビキチン化酵素を精製することを試みた。数段階の精製後、ゲル濾過カラムを用いて分子量の推定を行ったところ、このユビキチン化活性は>1,000kDaの分画に回収された。この分画をMJD1アフィニティーカラムに通すと、分子量90〜100kDaの蛋白質が特異的にMJD1に結合することが明らかとなった。 さらに精製を進めてマイクロシークエンシングによってその部分アミノ酸配列を決定し、遺伝子をクローニングすることに成功した。現在この遺伝子産物の生物学的重要性並びに神経変性疾患における封入体形成への関与を検討している。 続きを見る
5.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of サイクリン制御因子の細胞周期及び分化における機能に関する研究 — Function of cyclin regulatory factors in cell cycle control.
小林 英紀 ; KOBAYASHI Hideki
研究期間: 1999-2000
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概要: M期サイクリンの分解は細胞周期のM期進行制御に重要な役割を果たす。M期サイクリンに属するサイクリンAとサイクリンBはユビキチンに依存したプロテアソームによってM期に分解される。この分解過程にはM期サイクリンのN末端ドメインの機能が密接に関連している。本研究では、動物卵M期におけるA型サイクリンの分解機構を解析するため、サイクリンのN末端ドメインと相互作用する新規因子XDRP1をツメガエル卵からクローニングした。XDRP1をサイクリン分解がin vitroで進行する卵抽出液に加えると、サイクリンBの分解には影響がなかったが、サイクリンAの分解を抑制した。また、XDRP1をインジェクトすると、受精卵の分裂を阻害した。XDRP1はサイクリンAとは結合するが、サイクリンBとは結合しない。XDRP1はM期にリン酸化されるタンパク質で、in vitroでは、サイクリンAに依存したCDKキナーゼによりリン酸化されると考えられる。これらのことから、XDRP1はサイクリンAと特異的に結合してその分解を負に制御する抑制因子であることが示唆される。 カエルの卵細胞から同定されたXDRP1はそのN末端側にユビキチン様配列を含み、かつ出芽酵母のDsk2タンパク質のC末端ドメインを共有している。これらの知見に基づいて、N末端ユビキチン関連蛋白質XDRP1/Dsk2のタンパク分解制御における機能を酵母システムを用いて解析した。XDRP1の過剰発現による生育阻止を抑圧する変異株を数株分離したところ、プロテアソームのコアユニットPre2と調節ユニットのRpn1の変異であることがわかった。これらの結果から、XDRP1とユビキチン-プロテアソーム経路との機能相関が示唆される。 続きを見る