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1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 染色体複製開始とその制御を行う、動的かつ複合的蛋白質高次装置の機能構造特性 — Protein Dynamics in Complex Apparatus for the Initiation and Regulation of the Chromosomal Replication
片山 勉 ; KATAYAMA Tsutomu
研究期間: 2004-2006
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概要: DnaA蛋白質は複製起点と複製開始複合体を形成して2重鎖DNAの開裂という開始反応を遂行するほか、複製開始制御機構の標的因子ともなっている。本計画研究では、複製開始反応と開始制御反応の分子機構を、「DnaAが直接関わる、動的かっ複合的蛋白質相互作用として、特に蛋白質構造に基づいて理解する」ことを目指した。 1.全長DnaAの構造解析と複製開始複合体の構造解明 まず、超好熱菌DnaA蛋白質を精製して、機能解析した。大腸菌以外では初めてとなるin vitro複製開始再構成系を構築することに成功した。さらにこのDnaAを用い複製開始複合体の結晶作成を進めた。また、大腸菌DnaAのN末ドメインの機能構造解析を進め、DnaA-DnaA相互作用機構とDnaBヘリカーゼ装着機構を解明した。また、DnaAのATP複合体形成動態解析を進め、新たな機能構造を解明した。 2.DnaA/Hda/クランプ相互作用機構・機能構造相関 Hda機能解析を進め、Hdaの複合体形成との機能構想相関を見いだした。クランプの機能構造解析を進め、Hdaとの相互作用機構を検討した。さらに、新規のクランプ結合因子の機能解析を進めた。さらにDnaA相互作用因子の探索をプロテオミクス手法で行い、多種の因子を同定し、機能解析を進めた。 3.新規DnaA相互作用因子の機能構造解析:DnaA-DiaA複合体の機能解析 多種のDiaA変異体を分離し機能構造相関解析を進めた。DiaAの結晶構造解明に成功した。DnaA-DiaA複合体が複製開始複合体の形成促進を行うことを初めて解明した。 4.蛋白質構造とその機能特性に基づいた阻害剤設計と開発 DnaAドメインIVを結合標的とした化学修飾オリゴヌクレズチドを設計し、合成に成功した。これを用いて結合様式などの解析を進めた。 続きを見る
2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 蛋白質の機能向上をめざしたリゾチ-ムの分子設計 — Molecular design of lysozyme for the improvement of protein function.
井本 泰治 ; IMOTO Taiji
研究期間: 1988-1989
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概要: 蛋白質工学によりニワトリリゾチ-ムの機能向上を目的に以下の研究を行った。1.開発済みの大腸菌によるニワトリリゾチ-ムの生産系を用いて、N末端にMetが付加し、さらに種々のアミノ酸残基の置換を施した変異リゾチ-ムを生産し、これらを活性構造に巻き戻した。2.この系で生産したリゾチ-ムのN末端は天然型と異なるため、これを天然型にするために、N末端にMet-Tyrが付加したリゾチ-ムから出発して試験管内でこれを切り落とす方法を確立した。3.酵母の発現分泌系の最適培養条件を確立し、それにより種々の変異リゾチ-ムを生産した。4.大腸菌、及び酵母の系を用いて生産した種々の変異リゾチ-ムの性質を検討した結果、以下の事がわかった。(1)触媒基であるGlu35とAsp52の置換体は、いずれもリゾチ-ム活性がほぼ消失した。(2)Asp52の置換体は、基質結合能が低下した。(3)35位に導入した解離性残基のpkはすべて異常となり、この部位に電荷をおくことは不都合であることがわかった。(4)Trp108をGlnで置換すると、活性は消失し、安定性も極めて低下した。(5)β-シ-ト上のAsn46をAspで置換すると、活性が約1/4に低下した。(6)37位および101位をGlyで置換すると、溶菌活性が上昇した。(7)14位と15位を共に欠失させた変異リゾチ-ムの熱安定性は低下したが、活性は向上した。(8)α-ラクトアルフミン様のカルシウム結合部位を構築したリゾチ-ムの還元状態からの巻戻しはカルシウム濃度で制御できた。5.一方、安定性及び活性の向上したリリゾチ-ムを生産するためには、どの様な変異を導入すればよいかを天然の変異に学ぶために、猪、豚、スナメリ(小型鯨)、犬及び、シロカン(鳥類)のリゾチ-ムを単離し、それらの一次構造と活性及び安定性を調べた。機能の向上に寄与していると考えられるアミノ酸置換を検索中である。 続きを見る