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1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミクログリア及び神経細胞による活性酸素生成の分子機構
住本 英樹
研究期間: 2002
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概要: ミクログリアによる活性酸素生成を担うのは食細胞NADPHオキシダーゼであるが、その酵素本体は膜蛋白質gp91^<phox>であり、p22^<phox>と会合してシトクロムb_<558>を形成している。本酵素の活性化には、特異的アダプター蛋白質(p47^<phox>,p67^<phox>,とp40^<phox>:各々SH3ドメインをもつ)が刺激依存性に細胞質から細胞膜に移行してシトクロムb_<558>と相互作用する必要がある。一方、神経細胞による活性酸素生成は主としてNox4(gp91^<phox>のホモログ)が担うと考えられる。私共はオキシダーゼの活性化機構を研究し、平成14年度は以下のような成果を得た。 (1)p47^<phox>のPXドメインのphosphoinositides結合能が、p47^<phox>の膜移行及びオキシダーゼ活性化に必須であることを明らかにし、更に、この脂質結合能はp47^<phox>のリン酸化により誘導されることを示した。 (2)もう1つのオキシダーゼ活性化に必須の蛋白質p67^<phox>はそのC末側SH3ドメインを用いてp47^<phox>と結合するが、この結合が新しい様式のものであることを示し、複合体の立体構造を決定した。 (3)p67^<phox>に恒常的に結合している蛋白質として知られていたp40^<phox>の役割は不明であったが、p40^<phox>はp67^<phox>に結合してp67^<phox>(更にはp47^<phox>)の膜移行を促進することにより、オキシダーゼ活性化を正に制御していることを明らかにした。 (4)新規なオキシダーゼ調節蛋白質であるp41^<nox>(p47^<phox>のホモログ)及びp51^<nox>(p67^<phox>のホモログ)を同定・クローニングした。更に、これらがgp91^<phox>を活性化できることを示した。 (5)Nox4もp22^<phox>と会合していること、その活性化にはPKCが関与することを示した。 続きを見る
2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 生体防御を担う活性酸素生成型食細胞NADPHオキシダーゼの活性化の分子機構 — Molecular mechanism for activation of the reactive-oxygen-species-producing phagocyte NADPH oxidaae that is involved in host defense
住本 英樹 ; SUMIMOTO Hideki
研究期間: 2002-2003
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概要: NADPHオキシダーゼは活性酸素を生成する酵素であり、生成された活性酸素は生体防御において極めて重要な役割を担う。活性酸素生成型NADPHオキシダーゼのプロトタイプは食細胞に豊富に存在することから食細胞NADPHオキシダーゼとも呼ばれるが、その酵素本体は膜蛋白質gp91^<phox>であり、p22^<phox>と会合してシトクロムb_<558>を形成している。本酵素の活性化には、特異的アダプター蛋白質(p47^<phox>,p67^<phox>,とp40^<phox>:各々がSH3ドメインをもつ)が刺激依存性に細胞質から細胞膜に移行してシトクロムb_<558>と相互作用する必要がある。私共はオキシダーゼの活性化機構を研究し、以下のような成果を得た。 (1)p47^<phox>-p22^<phox>間の結合様式について詳細に検討し、p47^<phox>の2つのSH3ドメインがp22^<phox>の1つのプロリン・リッチ領域を挟み込むように認識し、この認識様式がオキシダーゼ活性化に必須であることを明らかにした。 (2)p47^<phox>のPXドメインのホスホイノシチド結合能が、p47^<phox>の膜移行及びオキシダーゼ活性化に必須であることを明らかにした。 (3)p67^<phox>はそのC末側SH3ドメインを用いてp47^<phox>と結合するが、この結合が新しい様式のものであることを示し、複合体の立体構造を決定した。 (4)p40^<phox>がp67^<phox>に結合してp67^<phox>(更にはp47^<phox>)の膜移行を促進することにより、オキシダーゼ活性化を正に制御していることを明らかにした。 (5)p41^<nox>(p47^<phox>のホモログ)及びp51^<nox>(p67^<phox>のホモログ)を同定・クローニングし、これらがgp91^<phox>と新規オキシダーゼNox1を活性化できることを示した。 続きを見る
3.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 生体防御に重要なNADPHオキシダーゼを構成する膜蛋白質間の相互作用機構 — Mechanism for interaction between gp91phox and p22phox : two membrane-integrated proteins of the phagocyte NADPH oxidase
宮野 佳 ; MIYANO Kei
研究期間: 2007-2008
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概要: 食細胞NADPHオキシダーゼ(gp91phox)は、生成する活性酸素が殺菌剤として機能することで、生体防御上重要な役割を果たしている。本研究では、これまで全く不明であったgp91phoxの安定化に必要なp22phoxとの結合部位に関する新たな知見を得た。また、低分子量Gタンパク質Racに特異的なアミノ酸配列は、gp91phox活性に関与しないこと、さらに、gp91phoxのNADPH結合ドメインが典型的な機構でNADPHを認識しているのではないことを明らかにした。 続きを見る
4.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 殺菌に重要な食細胞NADPHオキシダーゼを構成する膜蛋白質の相互作用機構の解析
宮野 佳
研究期間: 2011-2012
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概要: 食細胞NADPHオキシダーゼは、病原体微生物の貪食時にスーパーオキシドを生成する酵素であり、スーパーオキシドに由来する種々の活性酸素が強力な殺菌剤として働くことで、生体防御上重要な役割を果たしている。これまでに、食細胞NADPHオキシダーゼの活性化に必要な可溶性の活性化タンパク質の作用機構はかなり明らかにされてきたが、酵素本体である膜タンパク質Nox2(別名gp91phox)に関してはほとんど研究が進んでいない。Nox2の重要性は、その遺伝的欠損症である慢性肉芽腫症で示される。慢性肉芽腫症とは、Nox2による活性酸素の生成がまったく行われないため、食細胞である好中球の殺菌能が著しく低下し、幼少期より重篤な感染症を繰り返す遺伝疾患である。Nox2は同じく膜蛋白質であるp22phoxと会合している。Nox2とp22phoxの会合の重要性は、p22phoxの遺伝的欠損でも慢性肉芽腫症が引き起こされることからも示される。遺伝的にp22phoxが欠損した食細胞では、Nox2のmRNAは正常であるにもかかわらず、Nox2がタンパク質レベルで検出されないことから、Nox2とp22phoxの会合が、Nox2をタンパク質レベルで安定化すると考えられている。ところが、この会合によりどのようなメカニズムでNox2が安定化されるかはまったく不明なままであった。本研究で、私はNox2のp22phoxとの結合に必要な領域が膜貫通領域に存在することを明らかにした。さらに、膜貫通領域を構成する膜貫通セグメントのうち、いずれのセグメントが結合に関与しているかも同定することができた。これらの成果はp22phoxによるNox2のタンパク質レベルでの安定化のメカニズムを理解する上で重要な知見を与える。 続きを見る
5.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 食細胞特異的NADPHオキシダーゼとその活性発現 — Phagocytosis-specific NADPH-oxidase and its Induction by Phagocytosis
水上 茂樹 ; Minakami Shigeki
研究期間: 1985-1986
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概要: 1.細胞内pHの解析 遊走ペプチドFMLPなどで刺激されたヒト好中球の食作用様変化にともなう細胞内pHの変化を蛍光変化によって測定し、解析した。FMLPによる初期の細胞内酸性化およびそれに続く塩基性化はともに細胞外のカルシウムに依存し、カルシウムイオノフォアA23187によっても同様の変化が観察された。FMLPによる細胞内pHの変化はジフテリア毒素によっては影響されなかったが、百日咳菌毒素によって阻害され、細胞内pH変化にGTP結合タンパク質の関与する可能性がしめされた。 2.NADPHオキシダーゼの構成成分の機能的解析 食細胞特異的NADPHオキシダーゼはフラビンおよびb型チトクロームを含む複合体と考えられており、ユビキノン両者のあいだの電子伝達をしている可能性が示唆されていた。我々はユビキノン-1のNADPHオキシダーゼによる還元反応を解析し、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)によって阻害されないのはユビキノンが超酸化物により急速に還元されるためであり、ユビキノンが電子伝達成分である根拠はないことを示した。他の色素についても同様の結果を得た。 3.NADPHオキシダーゼの精製 本酵素(系)は量的に少なく膜成分のために、精製が困難であり、種々の精製方法の検討を続行している。精製方法の開発のために、好中球b型チトクロームにたいするモノクローン抗体の調製ならびにNADPHのジアルデヒド誘導体による酵素の標識法の開発を行い、成功した。この技術を慢性肉芽腫症患者白血球に用いて、この白血球はb型チトクロームを欠損するが、NADPHオキシダーゼのNADPH結合部位の存在することを示した。またモノクローン抗体を用いて正常ヒト白血球におけるb型チトクロームの細胞内局在を、免疫電子顕微鏡法によって明らかにした。 続きを見る
6.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 活性酸素シグナル生成系の制御機構の解明 — Regulatory mechanism for systems generating reactive-oxygen signals
住本 英樹 ; SUMIMOTO Hideki
研究期間: 2008-2012
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概要: 本研究は、活性酸素を生成する酵素であるNADPHオキシダーゼ(Nox)ファミリーの活性化制御機構の時間的空間的な全体像を明らかするものである。 平成23年度は、「Noxの活性発現に必要なタンパク質p22^<phox>とNoxとの結合様式」の解析を行い、Noxは膜貫通領域の2カ所を用いてp22^<phox>と結合することを明らかにし、この領域のアミノ酸置換を用いた実験により、今まで説明がつかなかった慢性肉芽腫症(食細胞Nox系が欠損する遺伝病)の症例の一部が説明可能になった。これは炎症などの病態解明に重要な知見を与えると考えられる結果である。更に、「Noxの各領域の役割」についてNoxのキメラタンパク質を用いて解析し、「NoxのN末膜貫通領域がNox2型であるかNox4型であるかによって、primary productとして生成される活性酸素の種類が決定されること」を明らかにするとともに、「Nox活性化タンパク質(p47^<phox>やp67^<phox>等)による調節を受けるかあるいは恒常的に活性酸素を生成するか否かを決めているのはC末細胞質領域であること」を示した。また、Nox2、p67^<phox>、Racの3者複合体の大量精製系を確立し結晶化を行った。Noxは膜上で均一に存在するのではなく、例えば遊走中の好中球ではNox2はその前方でのみ活性化されるし、Nox1は上皮細胞のapical側の細胞膜にのみ発現している。この様に、Noxの活性化は細胞の極性形成と強くcoupleしている。この細胞極性形成に必要な進化的に保存されたタンパク質であるmInscとLGNの複合体の結晶構造を2.6Aの解像度で決定した。LGNは8つのTPRモチーフをもちこれらがsuperhelixを形成しているが、そのsuperhelixの内側の凹面に沿ってmInscが結合することが明らかとなった。 続きを見る
7.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 活性酸素生成酵素ファミリーNoxの調節機構 — Regulatory Mechanism for the reactive oxygen-producing enzyme family Nox
住本 英樹 ; SUMIMOTO Hideki
研究期間: 2006-2007
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概要: 活性酸素を生成する酵素であるNADPHオキシダーゼ(Nox)ファミリーの活性化制御機構について以下のような成果を得た。(1)Nox2の活性化に関与するp40^<phox>は、N末から「PX-SH3-PB1」というドメイン構造をしている。「p40^<phox>-PXによるPI3P結合」が、PB1ドメインがPXドメインと分子内結合することによって負に調節されていること、その結果、「p40^<phox>のファゴゾーム膜への移行」も抑制されることを明らかにした。また、全長型p40^<phox>の結晶構造を解明した。(2)Nox2は、やはり膜蛋白質であるp22^<phox>とヘテロダイマーを形成しているが、このヘテロダイマー形成に必要な領域を明らかにした。また、Nox2はNADPHから電子を受け取り、その電子を伝達して最終的に酸素分子に渡しスーパーオキシドを生成する。この電子伝達に必要なアミノ酸残基の同定に成功した。(3)Nox1活性化に必要な蛋白質Noxo1は、細胞非刺激時は分子内結合により不活性型であるが、細胞刺激時には翻訳後修飾によるコンフォメーション変化うけ活性化されること、これがNox1活性化に重要であることを示した。(4)低分子量G蛋白質Racが、Nox1とNox3の活性化をpositiveに制御する因子であることを明らかにした。Nox1の活性化においては、RacとNoxa1との結合がNoxa1の膜移行とコンフォメーション変化の両者を誘導するのに重要であることを示した。また、Nox3の活性化、特にp67^<phox>存在下でのNox3活性化にRacが重要な役割を果たすこと、このRac1の作用はp67^<phox>の膜移行を促進することによるものであることを示した。(5)Rac3がNox1〜3の活性化に関与することを示した。また、いずれにおいてもRacのinser helixは不要であることを明らかにした。 続きを見る
8.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 癌細胞の増殖・浸潤に関与する活性酸素生成型NADPHオキシダーゼの活性化機構
住本 英樹
研究期間: 1999
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概要: 癌細胞の増殖・浸潤に関与する活性酸素生成型NADPHオキシダーゼの活性化には、低分子量G蛋白質Racとオキシダーゼ特異的シグナル伝達蛋白質(p47^<phox>,p67^<phox>とp40^<phox>)が移行して、細胞膜に存在する酵素本体シトクロムb_<558>(b_<558>)と相互作用する必要がある。 平成11年度は以下のような成果を得た。 (1)Racの活性化を検出する新しい測定法を開発し、好中球刺激時のRacの上流で作用するシグナル分子を同定した。Racは、P67^<phox>のN末領域に存在するTPRドメインを介して作用し、オキシダーゼを活性化することを明らかにした。 (2)b_<558>と細胞質因子の相互作用は、p47^<phox>ドメインとp22^<phox>(b_<558>の小サブユニット)の細胞質領域との結合に依存するが、p47^<phox>C末領域の3つのセリン残基のリン酸化が、SH3ドメインのunmasking、p22^<phox>との結合、及びオキシダーゼ活性化能誘導に必要であることを示し、更にアラキドン酸がリン酸化と協同的に働いてp47^<phox>の構造変化を引起こしオキシダーゼを活性化することを明らかにした。 (3)p40^<phox>は休止時細胞でp67^<phox>と会合しているが、これは新規なドメイン間(それぞれPCモチーフとPB1ドメイン)の新しいタイプの蛋白質間相互作用によるものであることを示した。PB1ドメインは酵母のシグナル伝達蛋白質Bem1pにも存在し、その役割を明らかにするとと共に、その3次構造決定に成功した。 (4)p47^<phox>のN末領域に新規ドメイン(PB2ドメイン)を見い出し、その3次構造決定すると共に、PB2ドメインがPIP結合ドメインであり、p47^<phox>の膜移行に必須であることを明らかにした。 続きを見る
9.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of SH3ドメインをもつアダプター蛋白質の活性化と高次構造変化のメカニズム
住本 英樹
研究期間: 1999
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概要: 食細胞NADPHオキシダーゼの酵素本体は、細胞膜のシトクロムb_<558>(b_<558>)である。本酵素の活性化には、特異的アダプター蛋白質(p47^<phox>,p67^<phox>とp40^<phox>:それぞれSH3ドメインをもつ)と低分子量G蛋白質Racが刺激依存性に細胞質から細胞膜に移行してb_<58>と相互作用する必要がある。 平成11年度は以下のような成果を得た。 (1)b_<558>と細胞質因子の相互作用は、p47^<phox>SH3ドメインとp22^<phox>(b_<558>の小サブユニット)の細胞質領域との結合に依存するが、p47^<phox>C末領域の3つのセリン残基のリン酸化が、SH3ドメインのunmasking、p22^<phox>との結合、及びオキシダーゼ活性化能誘導に必要であること、更にアラキドン酸がリン酸化と協同的に働いてp47^<phox>の構造変化を引起しオキシダーゼを活性化することを示した。 (2)Racの活性化を検出する新しい測定法を開発し、好中球刺激時のRacの上流で作用するシグナル分子を同定した。Racは、p67^<phox>のN末領域に存在するTPRドメインを介して作用し、オキシダーゼを活性化すること明らかにした。 (3)p40^<phox>は休止時細胞でp67^<phox>と会合しているが、これは新規なドメイン間(それぞれPCモチーフとPB1ドメイン)の新しいタイプの蛋白質間相互作用によるものであることを示した。PB1ドメインは酵母のシグナル伝達蛋白質Bem1pにも存在し、その役割を明らかにすると共に、その3次構造決定に成功した。 (4)p47^<phox>のN末領域に新規ドメイン(PB2ドメイン)を見い出し、その3次構造決定すると共に、PB2ドメインがPIP結合ドメインであり、p47^<phox>の膜移行に必須であることを明らかにした。 続きを見る
10.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 食細胞特異的シトクロームb_によるスーパーオキシド生成とその調節機構
住本 英樹
研究期間: 1996
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概要: 殺菌に関与する食細胞NADPHオキシダーゼの本体は細胞膜に存在するシトクロームb_<558>(gp91^<phox>とp22^<phox>の2つのサブユニットから成る)であり、その活性化には2つの細胞質因子(p47^<phox>とp67^<phox>)が移行してシトクロームb_<558>と相互作用する必要があるが、活性化の分子機構は殆ど解っていなかった。本年度は以下のことを見いだした。(1)gp91^<phox>にNADPH結合部位が存在すること。(2)シトクロームb_<558>と細胞質因子の相互作用は、p47^<phox>(2つのSH3ドメインをもつ)とp22^<phox>の結合によるが、これはp47^<phox>のN末側SH3ドメインとp22^<phox>細胞質領域のプロリン・リッチ領域(PRR)の結合を介しておこり、高親和性でかつ極めて特異的なものであること。また、この結合がNADPHオキシダーゼの活性化に必須であり、活性化のON/OFFを担うと考えられること。(3)p47^<phox>のC末端領域が負の調節領域であること(p47^<phox>のSH3ドメインは、自身のC末端領域によりmaskされており、活性化に伴いunmaskされ標的蛋白質-p22^<phox>-と結合できるようになる)。(4)p47^<phox>とp67^<phox>の相互作用は、主としてp67^<phox>のC末側SH3ドメインとp47^<phox>C末端部分のPRRとの結合によること。(5)p40^<phox>(オキシダーゼのmodulator)は休止時細胞でp67^<phox>と会合しているが、この結合は、新奇なドメイン間の全く新しいタイプの蛋白質間相互作用によるものであること。また、この新しいタイプのドメインが酵母のシグナル伝達蛋白質にも存在し、同様の蛋白質間相互作用が酵母のシグナル伝達系でも重要な役割を果たすこと。 続きを見る