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1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 光反応性レドック分子による遺伝子のマルチラベル化と超高感度電子計測
前田 瑞夫
研究期間: 1998-1999
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概要: 本研究は、化学センサーによる遺伝子の簡易かつ超高感度な電子計測を目的として、プローブDNAに多数の酸化還元活性分子を結合させることを試みるというものである。酸化還元物質としてはフェロセンを用いる。一方、遺伝子との結合にはDNA特異性の高いソラレンという光反応性化合物を利用する。このソラレン化フェロセンは単純な非対称2官能性試薬であるが、過去には全く類例が無かった。ジプロピレントリアミン型のスペーサを持つ分子と、テトラメチル型の4級アンモニウム塩をスペーサとする分子を合成した。後者はより親水性が高く、より高密度のDNAラベル化を期待した。まず、ゲル電気泳動法を用いて、この2つの分子がともに紫外光照射下でDNA二重らせんに結合することを確かめた。次いで、電極上に固定化したDNAに対し、これらのソラレン誘導化フェロセン分子を反応させ、その酸化還元反応活性を調べた。まずサイクリックボルタンメトリーを用いた検討から、フェロセンラベル化量を検討したところ約25pmol/cm2と求まり、高密度のDNAラベル化が達成されていることがわかった。フェロセンに由来するレドックス電流が掃引速度の1次に比例したことから、フェロセン分子が電極固定系として反応していることが確かめられた。これらの結果から、遺伝子の超高感度計測に適したDNAの電気化学的ラベル化法として、本研究で新たに合成したフェロセン・ソラレン複合体が有望であることを示した。今後はより定量的な検討と、実際の遺伝子計測に向けた条件設定を引き続き行わなければならない。 続きを見る
2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of RFLP(制限酵素DNA断片長多型)を利用したイネの連鎖分析 — Linkage analysis of rice by use of RFLPs (Restriction fragment length polymorphisms).
吉村 淳 ; YOSHIMURA Atsushi
研究期間: 1988-1989
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概要: 本研究課題は実施初年度から農林水産省生物資源研究所と北陸農業試験場のRFLP研究グル-プと共同研究を行った。初年度は、インド型品種Kadalathと日本型標識遺伝子系統FL134との日印交雑F_2約140個体を用い、RFLP連鎖分析を行った結果、数個の形態形質遺伝子とアイソザイム遺伝子を含む、約250個のRFLPマ-カ-からなるRFLP連鎖地図を作成した(矢野ら1989,Kishimoto et al.1989).このRFLP連鎖地図は座乗染色体既知の標識遺伝子を指標に、6連鎖群(染色体4,5,6,8,9,11)については、所属染色体を明らかにできたが他の連鎖群については不明であった。そこで本年度は、RFLP連鎖群の染色体決定をTrisomicsを用いて行った。また、RFLP連鎖地図と一般連鎖地図の対応の試みとして、白葉枯病抵抗性遺伝子Xa-1,Xa-2をRFLP連鎖地図に位置づけた。 Trisomics利用によるRFLP連鎖群の染色体決定には2手法を用いた。まず、日印交雑から得られた過剰染色体の異なる9型のTrisomicF_1の遺伝子量効果を利用し、RFLP連鎖群と染色体との対応を調べた。その結果、染色体1,7,10,12に対応するRFLP連鎖群を見いだすことができ、染色体3,4,6,9については初年度の結果を確認できた。次に,過剰染色体1,2,7,10をもつ日本型Trisomicsにインド型品種を交配して得られたF_2において、RFLPマ-カ-の分離をみた。その結果、染色体2に対応するRFLP連鎖群がみつかった。以上、イネの12の染色体のうち9染色体(染色体、1,2,3,4,6,7,9,10,12)については所属RFLP連鎖群を発見、確認し、初年度の結果を合わせるとすべての染色体に対応するRFLP連鎖群を決定できた。 染色体11に座乗するイネ白葉枯病抵抗性遺伝子Xa-1とXa-2とRFLPマ-カ-との連鎖分析を行い、lg-Ph-Xa-1-Xa-2-120-102の配列を推定した。また、一般連鎖地図とRFLP連鎖地図の比較検討を行った。 続きを見る
3.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of DNA構造体を反応場とする電極-溶液界面の電子移動反応とその制御
高木 誠
研究期間: 1995
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概要: 筆者らが開発したDNA固定化電極は、DNA2重らせん-小分子間相互作用の解析に有望であることがこれまでの研究で明らかになっている。本研究では、配列の明確な化学合成オリゴヌクレオチドを用いて同様にDNAバイオセンサを構築し、遺伝子計測について基礎的な検討を行うことを主たる目的とした。 末端にチオール基を持つDNA(HS-C6-5'-CGTACTGGATGCAAGCTTCA-3')とその相補鎖を化学合成し、金電極上に一本鎖または二重鎖として固定化した。同電極を用いて、フェリシアン/フェロシアン化物イオン(10mM)のサイクリックボルタモグラム(CV)を測定し、ここにアクリジンオレンジ(AO;0.2-40μM)を添加した場合の、CVピーク電流値に与える共存AO濃度の影響を調べた。測定は10mM KNO3を支持電解質とし、25℃にて行った。その結果、DNA固定化電極を用いてフェリ・フェロシアン化物イオンのCV測定を行うと、AOの添加によりボルタモグラムに変化が見られた。すなわちAO濃度に応じてピーク電流値が増加した。しかし一本鎖と二重鎖では応答する濃度域が一桁異なっており、これはAOがDNA二重鎖に特異的にインターカレートすることを反映していると考えられる。一方、電極に一本鎖を固定した後に相補鎖とハイブリダイズさせた場合は、二重鎖を固定化した場合とほぼ同様のAO濃度-電流応答曲線を与えた。相補鎖との二重らせん形成に伴いAO応答濃度が一桁低下するという事実は、このDNA固定化電極が遺伝子の計測に適用可能であることを示唆している。また、末端に酸化還元活性な官能基をもつオリゴヌクレオチドを合成し、これと電極上の一本鎖とのハイブリダイゼーションならびにその電気化学的計測を試みた。こうした第3の電気化学プローブを用いる遺伝子計測法も今後重要になると考えられる。 続きを見る
4.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of DNA構造体を反応場とする電極-溶液界面の電子移動反応とその制御
高木 誠
研究期間: 1994
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概要: 標記研究の要素技術として、1)チオール前駆体による二重鎖DNAの末端修飾、2)フェロセンラベル化オリゴヌクレオチドについて検討し、以下に述べる成果を得た。いずれも標記研究の目的達成と深く結びつくのみならず、単独の研究としても極めて重要な内容を持っている。 1.二重鎖DNAをアフィニティリガンドとするバイオセンサ DNA二重鎖の末端をチオール前駆体で修飾し、チオールの化学吸着をアンカーとした二重鎖DNAの固定化法を提案した。これを修飾電極に応用し、二重鎖DNAをアフィニティリガンドとする薬物・イオンセンサの開発に成功した。本年度は、マグネシウムイオンに高感度(10^<-7>Mレベル)かつ選択的に応答するイオンセンサを確立するこができた。 2.酸化還元活性なDNAプローブの合成と遺伝子DNAの高感度検出 電気化学的なラベルとしてフェロセンを導入した化学合成オリゴヌクレオチドを合成し、相補的な一本鎖DNAとの二重鎖形成について検討した。これを電気化学検出器を備えた高速液体クロマトグラフィーに適用し、フェムトモル量の遺伝子DNAあるいはm-RNAの検出に成功した。 続きを見る
5.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 合成オリゴヌクレオチド修飾電極を用いるバイオセンサ
中野 幸二
研究期間: 1996
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概要: 申請者は、金属-硫黄配位結合を利用したDNAの固定化、及びこれを修飾電極に応用したDNAバイオセンサについて研究してきた。これを背景に、ここでは遺伝子センシングシステムについて検討した。この方法では、金電極に固定化したオリゴヌクレオチド、これと相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド、及び酸化還元活性な置換基を導入したオリゴヌクレオチドの組合わせによって起こる、サンドイッチ複合体形成反応を利用する。 5'末端付近をホスホロチオエステル化したオリゴヌクレオチドを合成し、金電極にオリゴヌクレオチドをキャストした。この手法により、非常に安定なDNA修飾層を得ることができた。また、末端にフェロセニル基を導入した、酸化還元活性オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成した。コンジュゲートは、オリゴヌクレオチド合成段階で末端にアミノ基を導入し、活性エステル化フェロセンカルボン酸とのカップリングにより得た。 オリゴヌクレオチド修飾電極とコンジュゲートを組合わせると、固定化オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を持つDNAフラグメント(ターゲットDNA)の検出が可能であった。すなわち、ターゲットDNAの共存によりコンジュゲートを含んだサンドイッチ複合体が形成される。この反応は、電極表面へのフェロセンユニットの濃縮につながり、フェロセンの酸化還元反応に伴う電流をモニタすることでターゲットDNAの検出が可能であった。ターゲットDNAと非ターゲットDNAとの間では、電流値に明らかな差異が認められ、遺伝子センサとしての可能性を示すことができた。 続きを見る
6.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of DNAビニルグラフト法による遺伝子の多点標識と超高感度分析
前田 瑞夫
研究期間: 1996-1997
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概要: 本研究の目的は、ビオチンを多数個導入した新規ポリマーの開発と、これをDNAへ導入した超高感度DNAプローブの開発である。今年度は、平成8年度に開発したビオチン型重合性モノマーを用い、新規ビオチンペンダント型ポリマー標識剤の合成を行ったところ、合成には成功したものの、ビオチン含有量及び、ポリマーの分子量に問題があり、高感度化の目的には不足であることが分かった。この原因は、ビオチン型ポリマーに含有する不純物が、反応性を下げたこと、および、末端ソラレン型ポリマーの重合条件では、得られるポリマーの分子量に限界があることが考えられた。そこで、まず、前年度開発した方法を基礎として、高純度のビオチン型重合性モノマーの合成法を確立した。 また、検出時における標識アビジンとビオチンの結合効率を考慮して、重合基とビオチンユニットの間にアミノカプロン酸をリンカーアームとして挿入したビオチン型モノマーも新規開発した。これらのビオチン型モノマーは、純度が非常に高いものが得られたため、重合反応性は大幅に向上し、高濃度にビオチンを含むポリマーの合成が可能となった。 次に、これを用いてポリビオチン型DNA結合性標識剤を開発するに当たっては、DNA結合分子としてソラレンを用い、高分子量のポリマーが得られるビオチンモノマー、アクリルアミド、ソラレン型モノマー共重合体を設計した。これに用いる重合性ソラレンモノマーも新たに合成した。実際に共重合により得られたポリマーは、電気泳動による検討から、充分なDNA標識能力があることが実証され、実用的DNAプローブ作成用の試薬を開発する事ができた。 続きを見る