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1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 蛋白質の機能向上をめざしたリゾチ-ムの分子設計 — Molecular design of lysozyme for the improvement of protein function.
井本 泰治 ; IMOTO Taiji
研究期間: 1988-1989
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概要: 蛋白質工学によりニワトリリゾチ-ムの機能向上を目的に以下の研究を行った。1.開発済みの大腸菌によるニワトリリゾチ-ムの生産系を用いて、N末端にMetが付加し、さらに種々のアミノ酸残基の置換を施した変異リゾチ-ムを生産し、これらを活性構造に巻き戻した。2.この系で生産したリゾチ-ムのN末端は天然型と異なるため、これを天然型にするために、N末端にMet-Tyrが付加したリゾチ-ムから出発して試験管内でこれを切り落とす方法を確立した。3.酵母の発現分泌系の最適培養条件を確立し、それにより種々の変異リゾチ-ムを生産した。4.大腸菌、及び酵母の系を用いて生産した種々の変異リゾチ-ムの性質を検討した結果、以下の事がわかった。(1)触媒基であるGlu35とAsp52の置換体は、いずれもリゾチ-ム活性がほぼ消失した。(2)Asp52の置換体は、基質結合能が低下した。(3)35位に導入した解離性残基のpkはすべて異常となり、この部位に電荷をおくことは不都合であることがわかった。(4)Trp108をGlnで置換すると、活性は消失し、安定性も極めて低下した。(5)β-シ-ト上のAsn46をAspで置換すると、活性が約1/4に低下した。(6)37位および101位をGlyで置換すると、溶菌活性が上昇した。(7)14位と15位を共に欠失させた変異リゾチ-ムの熱安定性は低下したが、活性は向上した。(8)α-ラクトアルフミン様のカルシウム結合部位を構築したリゾチ-ムの還元状態からの巻戻しはカルシウム濃度で制御できた。5.一方、安定性及び活性の向上したリリゾチ-ムを生産するためには、どの様な変異を導入すればよいかを天然の変異に学ぶために、猪、豚、スナメリ(小型鯨)、犬及び、シロカン(鳥類)のリゾチ-ムを単離し、それらの一次構造と活性及び安定性を調べた。機能の向上に寄与していると考えられるアミノ酸置換を検索中である。 続きを見る
2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 大腸菌に生産させた変異ニワトリリゾチ-ムの巻戻しに関する研究 — Study on the Renaturation of Mutant Lysozymes Expressed in Schericia Coli.
山田 秀徳 ; YAMADA Hidenori
研究期間: 1989-1990
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概要: 遺伝子工学を利用して、大腸菌にジスルフィド結合を有する外来性蛋白質を生産させると、いわゆるインクル-ジョンボディ-となり不溶化することが多く、これが大腸菌の発現系の価値を著しく減少させている。そこで、大腸菌による外来蛋白質の生産系の有用性を高める目的で、大腸菌に変異ニワトリリゾチ-ム生産させ、不溶化したリゾチ-ムの可溶化、純度、N末端のプロセッシング及び巻戻し条件を検討し、以下の結果を得た。1.大腸菌に生産させたリゾチ-ムには、脱アミド化を受けたものが大量に含まれていた。2.N末端にMetが付加したリゾチ-ムでは、4個以上脱アミド化されたもの(約50%)は10%酢酸では抽出されなかった。3.抽出したリゾチ-ムをグルタチオンの酸化還元系で還元状態から巻戻すと、約25%しか巻戻らず、2個以上脱アミド化されたリゾチ-ムは沈澱して巻戻らないことがわかった。4.脱アミド化を受けたものを除いた場合、このリゾチ-ムの巻戻り率は50%であった。5.新たに開発したSH基の可逆的修飾試薬で、変性リゾチ-ムを可溶化し、カテプシンC消化を行なうことにより、リゾチ-ムのN末端を天然型にプロセスすることに成功した。6.N末端のMetを除去したリゾチ-ムの巻戻り率は80%に達した。7.N末端のMetとAla31→Valの2重に変異を持つリゾチ-ムは通常の巻戻し条件では全く巻き戻らかったが、巻戻し系に1M尿素を加えると、この変異リゾチ-ムも10%程度巻戻った。以上の結果より、脱アミド化や、疎水性アミノ酸のN末端への付加、あるいは疎水度を上昇させるような内部の変異は、いずれも変性リゾチ-ムの溶解度を減少させるために、巻戻り率を低下させると結論した。したがって、大腸菌による外来性蛋白質の生産系の有用性を高めるためには、N末端のプロセッシング法の開発に加えて、デアミデ-ス欠損大腸菌株を利用することが必要である。 続きを見る