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1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミトコンドリア膜への蛋白質の組み込みと膜の融合・分裂の分子機構
三原 勝芳
研究期間: 2002
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概要: ミトコンドリア膜蛋白質の標的化と膜への挿入、ならびにミトコンドリア膜の分裂・融合機構に関して以下の事柄を明らかにした。【Mt膜蛋白質挿入機構】(1)外膜輸送装置(TOM複合体):ラットTOM複合体に含まれる未知の構成成分のうちOM5をクローニングした。TOM複合体の主役TOM40のリコンビナントをチャネル活性と前駆体結合活性を持つ状態で精製することに成功した。この標品は電子顕微鏡で約20オングストロームの孔を持つ80オングストロームの粒子として観察され、現在、精製標品について結晶化を進めている。さらにTOM40のC-末側半分(TOM40f)がチャネル活性と前駆体蛋白質結合に必要十分な領域であることを明らかにした。TOM40fについても構造解析の準備を行っている。(2)外膜蛋白の標的化と挿入:異なる配向性と挿入シグナルを持つと推定される外膜蛋白質、Tom70 (N-末アンカー)、Tom5 (C-末アンカー)、Tom22 (分子内アンカー)、PBR (Peripheral Benzodiazepine Receptor;5回膜貫通型)を用いてin vivo、in vitroでの解析を行っている。このうちTom5のシグナルはC-末側の膜貫通領域の疎水性、ヘリックス構造、並びに膜貫通領域に続く3つの塩基性アミノ酸が重要であることを明らかにした。さらに哺乳類と酵母でシグナルの特性が顕著に異なることも明らかになった。(3)内膜挿入装置:内膜のポリトピック膜蛋白質preATM (ABC-transporter)とpreOxal (内膜挿入装置の一員)を用いてその標的化と膜挿入の解析を行っている。またpreOxal-ProteinA融合蛋白をミトコンドリアにスタックさせることに成功し、これを用いて膜挿入装置の解析を行っている。【Mt膜の融合分裂機構】Fzolの哺乳類ホモローグFzolAとFzolBをクローニングし、両者が組織特異的に発現していること、両者が協調的に働いてGTP-依存的にミトコンドリアの外膜融合を行うことを明らかにした。 続きを見る
2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミトコンドリアの生合成と形態制御の分子機構 — Molecular mechanisms of mitochondrial biogenesis and morphology regulation
三原 勝芳 ; MIHARA Katsuyoshi
研究期間: 2002-2006
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概要: ミトコンドリア(Mt)の膜に焦点をあて、膜蛋白質のMt標的化と膜挿入、外膜を介したアポトーシス因子の輸入輸出、ならびにMt膜の融合分裂制御の機構を明らかにする事を目的として研究を行い、以下の事柄を明らかにした。 【Mt膜蛋白質の標的化と膜挿入】配向性の異なる12種類のMt膜蛋白質について輸送ルートを解析し輸送シグナルの特性と輸送装置の関与を明らかにした。さらに、C-末端に膜結合領域を持つ蛋白質群の新規な輸送径路の発見と膜結合領域を複数回持つ膜蛋白質が外膜のTom40チャネルに依存せずTom70と膜間スペースの因子に依存して輸送される新たな機構の発見によってMt膜の生合成機構に新たな知見を加えた。輸送装置については哺乳類特異的な前駆体蛋白質受容体OM37の同定ならびに哺乳類で見いだされていなかったTom5およびTom6の同定、新規なTom40bの同定を行ったほか、輸送チャネルであるTom40の特性を明らかにした。【アポトーシス因子輸送】セミインタクト細胞を用いてBcl-2ファミリー蛋白質のMt輸送径路を初めて明らかにした。内膜結合型のアポトーシス誘発因子AIFの放出機構を解析し、細胞機能調節におけるMt内での蛋白質プロセッシングの重要性を初めて明らかにした。さらに、膜間スペースからのシトクロムCの放出を調節する新規内膜蛋白質MICS1(後述)を同定した。【Mt分裂融合の制御】Mt融合因子Mfn1,Mfn2の同定と機能解析、新規なMfn調節因子MIBの同定、内膜のMt融合因子OPA1(Optic atrophy原因遺伝子)のプロセッシングを介した融合調節とプロセッシング酵素の同定、Mt分裂因子Drp1のノックアウトマウスを作成しMt分裂反応の高次機能への関与の初めての証明、クリステ構造の維持とシトクロムcの放出を調節する内膜蛋白質MICS1(mitochondrial cristae and structure regulation)の同定、内膜蛋白質LETM1(Wolf-Hirschom Syndromen原因遺伝子)の呼吸鎖アセンブリーと内膜構造維持への関与の発見の成果を挙げた。 これらの研究成果によってミトコンドリアダイナミクスの研究に多大な貢献をすることができた。 続きを見る
3.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 膜タンパク質のオルガネラ標的化とトポロジー形成の分子機構 — Mechanism of organelle targeting and topogenesis of membrane proteins
阪口 雅郎 ; SAKAGUCHI Masao
研究期間: 2002-2004
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概要: 本研究では、これまでに明らかにした小胞体への膜タンパク質の組み込み様式をもとに、いくつかの代表的なマルチスパン膜蛋白質のすべての膜貫通セグメントの膜内配置機構を徹底的に解析した。アミノ末端側を膜透過させる1型シグナルアンカー配列が、予想外に長いドメインを膜透過できることを明らかにし、その際に、燐酸高エネルギー化合物や小胞体内腔の熱ショックタンパク質(hsp70,BiP)は関与せず、リボソームが膜透過自体に寄与し、膜透過の駆動力が初期段階とその後の連続的段階とで異なることを明らかにした。また、われわれが明らかにしてきた「内在性シグナルアンカー配列による他律的な低疎水性セグメントの膜組み込みモデル」を支持する、新たな事例を見出した。並行して、疎水性度の高い膜蛋白質が小胞体への標的化を回避し、ミトコンドリアやペルオキシソームなどの分泌経路以外のオルガネラに標的化するためのシグナル配列を解析し、膜蛋白質に特化したミトコンドリア標的化シグナルを明らかにした。このシグナルは小胞体への合成に共役した標的化を抑制し、ミトコンドリアへの合成後の輸入を実現するものであった。さらに、ミトコンドリア外膜の膜貫通蛋白質TOM22のトポロジー形成シグナルを明らかにした。またミトコンドリア蛋白質膜透過チャネルを形成するTOM40の大量発現、精製、再生系を確立し、低分子透過活性のあること、ミトコンドリアシグナルを認識し、分子の奥深くにそれを収納することを明らかにした。 続きを見る
4.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 動物細胞ミトコンドリアの形態形成因子FZOの機能解析
石原 直忠
研究期間: 2001-2002
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概要: ミトコンドリア(mit)の外膜に存在するGTPase、FZOは、酵母においてmit同士の融合に関与している。本研究において、FZOの哺乳動物ホモログを同定し、その機能解析を行った。ratの2つのFZO1のcDNA(rat FZO1A、FZO1B)を単離した。これらはお互いに63%の相同性を持っていた。特異的抗体を用いて分布を調べたところどちらもmit外膜に存在しており、また脳ではAが、心臓と精巣ではBが強く発現しており組織特異的な分布をしていた。これらのmit形態調節への関与とその機能分担を調べるため、野生型またはGTPase不活型のFZOをHeLa細胞に発現させたところ、GTPase変異型FZO1Aの発現細胞では通常の長い糸上のmitは観察されずmitの断片化が観察され、一方野生型FZO1B発現細胞ではmit外膜のネットワーク構造が活性化されていた。変異型FZO1Aの発現細胞の電顕観察において、2つのmit外膜が接触しその領域にFZO1蛋白質が濃縮されていたことから、mit融合が阻害されることにより外膜同士が接触した状態で停止していると考えられた。さらにFZO1Bによる外膜の伸張は野生型FZO1Aの共発現によって抑制された。以上の結果から2つのFZO蛋白質は異なる機能を持つことが示唆された。さらにRNAiにより2つのFZOの発現抑制を行った。それぞれの発現抑制によってmit融合活性が強く阻害されることから、両方がmit融合に必須であることが示された。さらにFZO発現抑制細胞のmitはアイソフォーム特異的に異なる形態変化が観察された。これらの結果から2つのFZO1蛋白質は細胞内で協調的にmit形態調節に機能しており、そのバランスによってmit形態が変化しうることが示された。 続きを見る
5.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 膜蛋白質の局在及びトポロジー形成原理の解明 — Mechanism of organelle targeting and topogenesis of membrane proteins
阪口 雅郎 ; SAKAGUCHI Masao
研究期間: 2003-2004
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概要: 蛋白質の細胞内局在と膜内構造形成の原理を解明することによって、ゲノムがコードするすべての膜蛋白質の立体構造、細胞内局在および生物機能の予測法の確立に貢献することを目的とした。これまでに明らかにした蛋白質の膜への組み込み様式をもとに、いくつかの代表的なマルチスパン膜蛋白質のすべての膜貫通セグメントの膜内配置機構を徹底的に解析した。アミノ末端側を膜透過させる1型シグナルアンカー配列が、予想外に長いドメインを膜透過できることを明らかにし、その際に、燐酸高エネルギー化合物や小胞体内腔の熱ショックタンパク質(hsp70,Bip)が関与せず、リボソームが膜透過自体に寄与し、膜透過の駆動力が初期過程とその後の連続的過程とで異なることを明らかにした。また、ゲノム情報科学解析を基にして提案された、低疎水性セグメントの新たな組み込み様式を、モデル蛋白質を使って検討し、妥当性を検証できた。並行して、疎水性度の高い膜蛋白質が小胞体への標的化を回避し、ミトコンドリアやペルオキシソームなどの分泌経路以外のオルガネラに標的化するためのシグナル配列を解析し、膜蛋白質に特化したミトコンドリア標的化シグナルを明らかにした。このシグナルは小胞体への合成に共役した標的化を抑制し、ミトコンドリアへの合成後の輸入を実現するものであった。さらに、ミトコンドリア外膜の膜貫通蛋白質TOM22のトポロジー形成シグナルを明らかにし、またミトコンドリア蛋白質膜透過チャネルを形成するTOM40の大量発現、精製、再生系を確立し、ミトコンドリア認識シグナルの機能解析への道を開いた。 続きを見る
6.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of CIDPにおける膜蛋白質を標的としたantigen microarray解析
川尻 真和
研究期間: 2010-2012
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概要: K23年度はCIDP患者血清におけるantigen microarray解析のために、(1)収集した患者血清の臨床情報の解析、(2)末梢神経由来膜蛋白ライブラリーの作製、(3)CIDP患者血清を用いたantigenmicroarray解析の開始、(4)CIDP特異的な標的自己抗体の候補標的抗原の同定を行った。昨年度に保存血清を収集したCIDP患者の臨床的、電気生理学的解析を行い、典型的なCIDP症例の選別および病型分類を行った。CIDPでは典型的な左右対称性のCIDPから左右非対称な異常をきたすMADSAM、遠位優位の障害をきたすDADSなど臨床的不均一性がみられ、なかでも自己抗体の関与が最も疑われる典型的なCIDP症例10例の血清をmicroarray解析の対象とした。Microarrayに使用するために、膜蛋白ライブラリーからsplit primer PCR法による蛋白作製をおこなった。これらの血清、蛋白を用いたantigen microarrayを開始した。また、一部のCIDP患者血清にて同定された、自己抗体の候補抗原蛋白の同定についての解析を行い、免疫組織化学染色、ウエスタンブロット法による同定結果に加えて、ELISA法、候補蛋白遺伝子導入を行ったHEK293-T細胞を用いた免疫細胞化学染色法により、自己抗体が抗neurofascin抗体であることを同定した。CIDPにおける本抗体の存在について、多角的方法により同定した研究はなく、今後のCIDPの診断、病型分類において重要と考えられる結果が得られた。 続きを見る
7.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 小胞体における蛋白質膜透過の一分子観察
阪口 雅郎
研究期間: 2004-2005
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概要: 真核細胞の小胞体では、さまざまな蛋白質が膜を透過し、膜蛋白質が膜に組み込まれている。このダイナミックなプロセスにはトランスロコンと呼ばれるポリペプチド鎖膜透過チャネルが関わっている。トランスロコンはきわめて多種類の蛋白質ポリペプチド鎖を容易に膜透過させるという驚異的な作用をもつ。本研究は小胞体トランスロコンにおけるポリペプチド鎖の移動透過過程を一分子レベルで観察し、透過の経時変化、移動速度、移動頻度、方向性などを測定可能とすることを目指した。高純度で高い蛋白質膜透過活性を有する小胞体膜標品の取得、ウサギ網状赤血球溶血液を用いた高効率タンパク質合成系の大量調整を行った。さらに、われわれの発見した1型シグナルアンカー配列のアミノ末端側にジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)ドメインを融合した場合、高効率で膜透過できること、この透過が特異リガンドであるメトトレキセートを添加することによって完全に抑制されること、このリガンドを除去することによって高効率で膜透過を再開できること、この過程には熱ショック関連蛋白質や燐酸高エネルギー化合物は不要なことを明らかにした。さらに、より制御しやすいポリペプチド鎖膜透過制御実験系を確立し、小胞体トランスロコン内には複数のシグナル配列と複数の親水性膜透過途上セグメントが収容されること、膜透過制御要因であるポリペプチド鎖上の正荷電アミノ酸残基が予想外に長距離での効果を発揮できことなどを明らかにしつつある。 続きを見る
8.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 蛋白質ジスルフィド結合の創生に関わる細胞マシーナリの構造生物化学 — Structural studies on the cellular machineries involved in protein disulfide bond generation
稲葉 謙次 ; INABA Kenji
研究期間: 2007-2010
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概要: ジスルフィド結合の形成・開裂は、タンパク質の高次構造形成およびミスフォールドタンパク質の分解除去において極めて重要な酸化還元反応である。本研究代表者は、大腸菌およびヒト細胞の小胞体におけるタンパク質ジスルフィド結合において中心的役割を担う膜酸化酵素DsbBとフラビン酵素Ero1αの構造生化学的研究を主たる研究テーマとして進め、それらの結晶構造解析に成功した。この成果に加え、ミスフォールドタンパク質の分解除去に関わるジスルフィド結合還元酵素ERdj5全長の結晶構造解析にも成功し、同酵素が促進する一連の小胞体関連分解経路の分子機構を解明するに至った。 続きを見る
9.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of マイトトキシンの疎水性部分の合成と作用標的分子の解明 — Synthetic studies of the hydrophobic part of maitotoxin for elucidating its target proteins
大石 徹 ; 01SHI Tohru
研究期間: 2009-2011
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概要: マイトトキシン(MTX)は強力な生物活性を発現する巨大な梯子状ポリエーテルであり,天然から微量しか得られないため活性発現機構や作用標的分子は未解明である。我々は, MTXが生物活性を発現する際に全構造が必須なのではなく,重要な部分構造が存在するという仮説を提唱し, MTXの生物活性を阻害する人工分子の創成を目的として研究を行った。MTXの疎水性部分に相当する天然物の部分構造,および人工梯子状ポリエーテルを設計・合成して生物活性を評価した結果,溶血L活性および細胞内へのCa2+流入活性において,それぞれこれまで報告されている中で最も強い阻害剤になることを見出した。 続きを見る
10.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of チトクロームP450の小胞体膜局在化機構ならびに細胞内動態
阪口 雅郎
研究期間: 1996
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概要: 本研究では真核細胞の小胞体膜蛋白質の典型としてチトクロームP450(以下P450)をとりあげ、小胞体膜蛋白質の小胞体膜局在化機構ならびに細胞内動態について、以下のことを明らかにした。 1、P450と、同じ膜内トポロジーと同様の分子量をもちながら細胞内局在が異なるsynaptotagmin2(以下Stg2)との組換え体を用いて小胞体残留に必要な配列特性を調べた。先ず、培養細胞系で発現させたStg2分子は、小胞体型のNリンク糖鎖付加を受け、その後その糖鎖の複合型への変換とOーリンク型糖鎖付加という2種の異なる修飾を受け、細胞膜表層まで到達することを明らかにした。このことから、今後Stg2変異分子の細胞内局在が、これら複数の修飾を指標として追跡できると考えられた。ついで、P450の膜結合に関与するアミノ末端の疎水性セグメントをStg2の膜貫通セグメントに導入しても、小胞体局在の挙動を示さないことを明らかにした。これは、P450の膜貫通セグメントが小胞体局在に十分であるとの報告には再考が必要なことを示している。さらに、Stg2の疎水セグメントがP450よりも長いことに着目し、膜貫通セグメントのアミノ酸残基数と局在との関わりを調べた。その結果、27アミノ酸残基からなる、Stg2の疎水性セグメントから3-4残基欠損させるだけで、小胞体局在型に変換されることが判明した。 2、小胞体残留型の変異にStg2は発現が高いが、分解も非常に早く60分以内で半減することが明らかになった。現在、この変異Stg2分子の小胞体膜上での分解系の解析を進めている。 続きを見る