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助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 脂肪滴構成蛋白perilipin遺伝子の発現調節機構と病態生理学的意義の解明
谷口 晋
研究期間: 2001-2002
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概要: 1.ADRPプロモーター領域の解析 前年度PPARγライガンド(チアゾリジンダイオン、15-デオキシ-12,14-プロスタグランジンJ2)、PMAなどがADRP発現を調節していることを見いだしていたが、さらにマウスADRP遺伝子promoterの-2090〜-2005bpの領域にPMAの作用点を認めた。またこの作用にはPEA3/AP-1複合配列が関与していることを見いだした。 2.マウス心臓ADRP関連蛋白cDNAのスクリーニング λTriplexシステムを用いてマウスADRPcDNAをプローブとしてマウス心臓cDNAライブラリーよりADRP関連のクローンをスクリーニングし、いくつかのクローンを得、それらをplasmidへconversionし解析を行ったが、現在のところADRPとの関連は明らかにできていない。現在ADRP関連蛋白をyeast two-hybrid法によってもスクリーニングし、関連の可能性のあるクローンとしてprotein phosphatase 2A methylesterase-1(PME-1)が得られたため、解析を行っている。 3.ヒトperilipinゲノムの全構造の決定 上記研究を優先したため、いくつかのクローンについて、DNA配列の解析は進行しているが、エクソン、イントロン配列の決定までには至っていない。欠損している部分が示唆されているため、その部位のスクリーニングを行っており、早急にエクソン、イントロン配列を決定したい。 続きを見る
2.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 心筋リモデリングにおける心筋線維化の分子機序 — Matrix Degradative Enzyme Activities on Cardiac Remodeling in Heart Failure
牧野 直樹 ; MAKINO Naoki
研究期間: 2002-2003
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概要: 心筋リモデリングには機械的刺激や神経・体液性因子の活性化が挙げられ、心筋細胞の肥大とともに間質の線維化が生じる。本研究では心筋リモデリング過程における細胞外基質の合成・分解に関与するmatrix metalloproteinase(MMP)とそれに関与する液性因子やサイトカインとの制御機構を明らかにし、心筋細胞と線維芽細胞とのシグナル伝達系のクロストークを研究した。今回、新生児ラット心筋より心筋細胞および線維芽細胞を個別に単離し、48時間低酸素条件(95%N2+5%CO2)にて培養し、再酸素化(95%Air+5%CO2)における細胞障害における脳性ナトリウム利尿ホルモン(BNP)の発現様式とその制御機構について検討した。併せてリモデリングに関与するTNF-a、IL-1bなどのサイトカインやMMP, TIMPの発現を検討した。BNPの発現は再酸素後3時間後に最も強くmRNAと蛋白の発現を,認め以後漸減した。同時に培養液中にコラーゲンI, III型の分泌も認めた。MMP, TIMPの発現は再酸素後30分より発現を認めた、以後漸減した。また、この再酸素化におけるBNPの変化はAngiotensin IIの前処置と同様であった。現在、ACE阻害剤、Angiotensin II拮抗薬MMP阻害剤の前処置におけるBNPの発現効果について検討しているが、チアゾリヂン誘導体であるPPAR-r agonistであるPioglitazone(0.1-10uM)の前処置においては有意に減少した。この変化はNFk-Bの抑制剤で消失することから、NFk-B経路を介していると考えている。 続きを見る
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 心不全におけるミトコンドリアDNAの酸化損傷とその防御・修復機構の役割の解明 — Role of oxidative mitochondrial DNA damage and its preventive mechanisms in the development and progression of heart failure
筒井 裕之 ; TSUTSUI Hiroyuki
研究期間: 2002-2004
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概要: 酸化ストレスは、動脈硬化や虚血-再灌流傷害ばかりでなく、心筋リモデリング・心不全の形成・進展においても重要な役割をはたしていることがあきらかにされてきた。 我々は、心不全に陥った心筋のミトコンドリア電子伝達系で産生された活性酸素が、心筋細胞のミトコンドリア自身、特にミトコンドリアDNAをターゲットとして、その損傷を引き起こすことをあきらかにした。ミトコンドリアDNA傷害は、電子伝達系の複合体酵素の活性低下、電子の伝達障害をきたし、さらなる活性酸素種の産生をもたらすため、悪循環を形成し、ミトコンドリアでの酸化ストレスをさらに亢進させると考えられた。 さらに、心不全におけるミトコンドリア転写因子A(TFAM)の役割を解明した。近年、TFAMは、ミトコンドリアDNAの複製および維持においても重要な役割を果たしていることが示唆されている。マウスの心筋梗塞後の不全心筋においても、ミトコンドリアDNAのコピー数の減少に伴いTFAMタンパク量が減少していた。したがって、TFAMは、ミトコンドリアDNAコピー数の制御および機能の維持をつかさどっており、その量的減少はミトコンドリアDNAの減少をもたらし、ミトコンドリア呼吸鎖の機能低下から、心機能低下に至ると考えられた。そこで、ミトコンドリア転写因子の遺伝子過剰発現マウスに冠動脈結窄による心筋梗塞を作成したところ、心筋におけるミトコンドリアDNA傷害が抑制された。さらに、心筋梗塞後の左室リモデリングが抑制され、生存率が改善することを見出した。 本研究により、ミトコンドリア由来の酸化ストレスが、ミトコンドリアDNA傷害さらに、心筋の構築および機能変化を引き起こすことによって心不全の形成・進展に密接に関与することがあきらかとなった。 続きを見る
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Cover image of 単一心筋細胞の細胞内灌流法による起電性イオン交換機転の定量的解析 — Quantitative analysis of the electrogenic ion exchange current using the cell dialysis method in the isolated cardiac myocytes.
野間 昭典 ; NOMA Akinori
研究期間: 1988-1989
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概要: 心筋細胞内のCa濃度の調節は、細胞の収縮やいろいろな細胞応答にとって最も基本的なものである。細胞内のCaイオン濃度は静止時に0.1μM程度であり、これは細胞外の濃度の10^4分の1である。これを維持するための細胞膜の機転として、Na/Ca交換機転が考えられる。我々はNa/Ca交換にともなって発生する膜電流を記録し、その逆転電位を測定することによって、NaイオンとCaイオンの交換比率を確定することを研究目的とした。Na/Ca交換電流は既に心筋細胞と眼桿体細胞外節で記録されている。その電流は細胞内外のNaとCaに依存し、LaやNiなどの重金属イオンによって抑制される。しかし、依然として最も基本的な逆転電位とイオン濃度の関係を調べる必要があった。実験にはモルモット心より単離した心室筋を用い、これにパッチクランプ法を適用した。細胞内にNaイオンを負荷した状態で、細胞外にCaを与える前後の電流の差をNa/Caイオン交換電流として記録しているが、一定のCaを細胞外に与え続けているにもかかわらず、測定される電流は時間と共に数十秒の過程で減衰し、一定の電流値に達する。この機序として、イオン交換機転によって運ばれたCaが細胞内に蓄積したか、あるいは細胞内のNaイオンの減少があったことが結論された。そこで、交換比率3Na:1Ca交換の平衡電位を計算によって求め、その電位を保持電位としたところ、ランプパルスで記録される電流-電圧曲線の時間的な変化はほとんど認めることがなかった。Na/Ca交換電流をNi感受性の電流成分として記録したところ、逆転電位はNa濃度変化、Ca濃度変化の実験で理論値とよく一致することが証明された。我々の測定している電流が確かにNa/Ca交換に基づくものであることと、その交換比率は3Na/1Caであることを結論した。 続きを見る
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 心筋筋小胞体の微小カルシウム放出の生理的意義に関する電気生理学的研究 — An electrophysiological study on miniature Ca relelase from the sarcoplasmic reticulum in cardiac myocytes.
穎原 嗣尚 ; EHARA Tsuguhisa
研究期間: 1988-1989
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概要: モルモット単一心室筋細胞において、筋小胞体からCaを放出させる目的で10-25mMのカフェインを作用させると、全細胞膜電位固定下においてパルス状微小内向き電流がバ-スト状に発生することが見いだされた。このバルス状電流について明らかになったことは以下の通りである。1.この電流の発生は、細胞内Ca注入や膜脱分極(細胞の収縮を伴う)によって増強するので、Caによってひきおこされたものである。すなわちカフェインにより筋小胞体から放出されたCaがこの電流を活性化している。2.このことは、筋小胞体のCa放出を特異的に阻害するリアノジン作用下ではカフェインはパルス状電流を発生させかなったことからも支持される。3.この電流が強く発生するときは細胞はほとんど収縮しないが、発生のない細胞は強縮し細胞死に至ったことから、Caの細胞外排出機構との関連が示唆された。4.セシウムを細胞内に負荷することにより背景膜電流を強く抑制した条件下で実験を行った結果、パルス状内向き電流の膜電位依存性を明らかにすることができた。すなわち、この電流はあたかもシングルチャネル電流のごとく振舞い、そのコンダクタンスはおよそ250pSであり、逆転電位はおよそ-10mVであった。5.この逆転電位値からチャネルのイオン特性は非特異的であることが予想されたが、事実細胞外NaをLiに置き換えてもパルス状内向き電流は発生した。以上、細胞内Caがコンダクタンスの非常に大きい非選択性陽イオンチャネルを活性化することが明らかとなった。このチャネルは、密度が他のイオンチャネルに比較して極端に低いので、形質膜のある特定の部位のみに分布していることが予想される。おそらく形質膜小胞体接着部位にあって、Caの排出、したがって細胞のCaホメオスタシスに関連するチャネルであろう。今後この点を含めてこのチャネルの生理的意義についてさらに研究を展開してゆきたい。 続きを見る
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 内向き整流カリウムチャンネルのマグネシウムイオンによる整流性発現機序
松田 博子
研究期間: 1988
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概要: 心筋内向き整流カリウム(K)チャンネルの外向き電流は、生理的濃度の細胞内マグネシウム(Mg)イオンにより選択的に抑制され、内向き整流特性が生じる。Mg濃度が2〜10μMの場合、外向きの単一チャンネル電流に単位電流の3分の1と3分の2の大きさのサブレベルが出現し、電流が流れないゼロレベルとチャンネルが完全に開いているレベルを含む4つのレベル間を行き来する。チャンネルが各レベルに滞在する時間が、二項分布に従うことから、このチャンネルは3つの等しい伝導ユニットで成り立っており、それぞれの伝導ユニットが互いに無関係にMgによりブロックされると考えられた。 本研究では、内向き電流がブロックされる場合、同様の現象がおきるかどうか調べた。モルモット単一心室筋細胞をコラゲナーゼで単離し、10-100μMのCs^+または20-100μMのRb^+を電極内液に加えて、内向き整流Kチャンネルの内向き単一電流を記録した。Mgによる外向き電流のブロックでは、全てのチャンネルでサブレベルが観察されたのに対し、内向き電流では、20%の例でサブレベルが観察されるにとどまった。これらの例ではMgブロックにおけると同じように、チャンネルが各レベルに滞在する時間は二項分布に従い、伝導ユニットが互いに無関係にブロックされることが示唆された。残りの80%の例では、ゼロレベルと完全に開いたレベルを行き来するだけであった。ゼロレベルと完全に開いたレベルの滞在時間を、同一条件(ブロッカー濃度と電位)で2つの群で比較すると完全開時間は両群で差がなく、ゼロレベル時間は、サブレベルを示さない群で2〜3倍延長していた。Cs^+やRb^+によるブロックの場合、大多数のチャンネルでは、1つの伝導ユニットがブロックされると、他の2つのユニットが瞬時に閉じると考えられる。各ユニットがどのような機構により協調するのかは、残された研究課題である。 続きを見る
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 内向き整流カリウムチャンネルの細胞内マグネシウムイオンによる整流性発現機序
松田 博子
研究期間: 1989
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概要: 心筋内向き整流カリウム(K)チャンネルの外向き電流は、生理的濃度の細胞内マグネシウム(Mg)イオンにより選択的に抑制され、内向き整流特性が生じる。Mg濃度が2-10μMの場合、外向きの単一チャンネル電流に単位電流の1/3と2/3の大きさのサブレベルが出現し、電流が流れないゼロレベルとチャンネルが完全に開いているレベルを含む4つのレベル間を行き来する。チャンネルが各レベルに滞在する時間が二項分布に従うことから、このチャンネルは3つの等しい伝導ユニットで成り立っており、それぞれの伝導ユニットが互いに無関係にMgによりブロックされると考えられる。 本研究では、内向き整流特性の機序についてさらに知見を得るため、コラゲナ-ゼで単離したモルモット単一心室筋細胞を用い、細胞内外のK濃度を変え、Mgブロックがどう変化するかを調べた。外向きに開いたチャンネルの平均電流を、細胞内Mg濃度0-100μMの範囲で測定し、Mgが存在しないときの値に対し標準化した。標準化電流とMg濃度の関係は伝導ユニット内の結合部位に1つのMgイオンが結合することを示した。標準化電流を電位に対しプロットすると、細胞内Kを45mMに減らした時のデ-タは内外とも150mMの対照時のデ-タと重なったのに対し、外液のKを30mMに減らした時のデ-タは約30mV負側に平行移動した。また解離定数を電位に対しセミログプロットすると、細胞内Kを減らした時のデ-タと対照時のデ-タが同じ直線(傾きは負)上に位置したのに対し、外液のKを減らした時のデ-タはやはり約30mV負側に平行移動した。これらの結果は外液のKイオンがMgブロックを緩和することを示す。緩和の機序として(1)外液のKがMgを結合部位から追い出す、(2)外液KとMgが結合部位をめぐり競合するという2つの可能性がある。サブレベルの解析は後者の機序によることを示唆した。 続きを見る
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ギャップ結合斑の臓器・機能の相違による形態特異性にかんする研究 — Ultrastrructural Variations of Gap Junctions Correlated with Tissue Types or Funtions.
柴田 洋三郎 ; SHIBATA Yosaburo
研究期間: 1986-1987
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概要: 1.新しいディープエッチレプリカ技法として, 試料反転エッチング法を開発した. これは新鮮標本中に溶解する塩類や高分子物質などが, 水の昇華に伴ない析出沈着するのを防止するのに有効であり, ギャップ結合膜のレプリカ観察や同定が極めて容易となった. 2.心筋ギャップ結合斑の細胞質側表面の観察では, 細胞膜裏打ちに覆われた非結合部膜に比べ線維の付着挿入が疎であり, 低い敷石状粒子構造の配列を認めた. これは肝細胞の平坦無構造なギャップ結合斑とは相違するが, 親水性通路の開口部に相当する小孔は, いずれにも確認できなかった. 3.妊娠末期に急激に形成される子宮平滑筋ギャップ結合の増殖機構をみるため, 片側子宮のみ妊娠着床したラットを用いて部位による分布や大きさの変動を定量的に分析した. その結果, ギャップ結合は非常に動的な構造であり, その形成には, 分娩前の増加を引き起こすホルモン等の全身的な要因でけでなく, 分娩中に平滑筋の収縮に関係した増加を生じる局所的要因によっても支配されていることが判明した. 4.心筋と肝細胞のギャップ結合斑細胞質表面の相違に基づいて, 種々の組織細胞に分布するギャップ結合の分類を試みた. ディープエッチレプリカ観察により, 血管内皮・毛様体上皮・子宮平滑筋・肝腹膜中皮では心筋と同じく, PF面粒子に対応した粒子配列構造が存在した. 他方, 胃粘膜上皮・腸上皮・腎尿細管・子宮内膜上皮では肝細胞と同様の平坦なギャップ結合膜面を呈した. これは細胞質内領域が相違する, 少くとも2種以上の異なったギャップ結合蛋白質が存在し, その分布は機能的相違を反映するよりもむしろ, 非上皮性組織と上皮由来組織との組織特異性による可能性を示唆する. 分布がサイトケラチンの有無と類似し, 両者に共通する組織分化過程の存在を推測させ, この観点からも興味深い. 続きを見る
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 心筋筋小胞体の振動性カルシウム放出の生理的意義に関する電気生理学的研究 — Electrophysiological study on the physiological roles of the oscillatory release of calcium from the sarcoplasmic reticulum in myocardium.
穎原 嗣尚 ; Ehara Tsuguhisa
研究期間: 1986-1987
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概要: 乳頭筋の実験において, 筋小胞体に発生する振動性Ca放出の性質を調べた結果, この現象は遅延後脱分極や後収縮に関与するのみならず, 細胞のCaホメオスタシスの一因子となっていることが示唆された. すなわちMgイオンは小胞体の振動性Ca放出を抑制するが, 同時に単収縮力を増大させることが見出された. これはMgが振動性Ca放出を抑えた結果小胞体のCa維持量が増加したことによると考えられる. 放出されたCaは形質膜の機構により細胞外に排出されるのであろう. これに対しカラェインは小胞体のCaを放出させ同時にCa吸収を抑制するので小胞体Caを減少させるという所見も得られた. 以上の実験は後電位や後収縮が発現する条件下で行ったものであるが, 正常な心筋においても小胞体の振動性Ca放出は微視的レベルで起こっていると考えられ, それが小胞体の従って細胞のCaホメオスタシスに関与している可能性がある. そこで筋小胞体由来のCaが形質膜にどのような電気現象を発生させるかを精密に検索するため, 単一心筋細胞を用いて膜電位固定下にカフェインを作用させた. その結果, カフェインは特異なパルス状内向き電流(20〜30pA)を発生させることが見出された. この電流はNa依存性であるがNaのLi置換によっては消失しない. 電流発生の様相からして, これは形質膜直下の小胞体のCa放出活動に由来している可能性が高く, 形質膜小胞体機能連関という観点から興味深いものである. 現在その本態についてなお研究中である. つぎに, 単離細胞のパッチクランプにおいて, 細胞内Caにより活性化される陽イオンチャネルを同定することができた. このチャネルはいわゆる一過性内向き電流に寄与するものと考えられる. このように, Caによって活性化される膜電流を2種類観察できたが, これらと膜のCa排出機構さらには細胞のCaホメオスタシスとの関連を今後さらに研究してゆくべきものと考える. 続きを見る
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Cover image of 細胞の磁気操作による毛細血管網を含む生体組織の構築
井藤 彰
研究期間: 2006-2007
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概要: 平成19年度は申請書の実験計画通り、以下の通りに進めた。 1.磁力を用いた肝実質細胞一線維芽細胞からなる共培養細胞シートの構築 線維芽細胞(NIH3T3細胞)と肝癌細胞(HepG2細胞)に磁性ナノ粒子を取り込ませて磁気ラベルし、それぞれの細胞を、磁石を設置した超低接着性培養皿に播種した。播種された細胞は、培養皿底面に接着することができないために、細胞間で結合・接着をはじめて、NIH3丁3細胞とHepG2細胞からなる共培養三次元組織を形成した。この三次元共培養により、HepG2の肝機能の一つであるアルブミン分泌能が向上したことから、我々の開発した「磁力を用いる細胞の磁気操作法」により、機能する三次元組織の構築に成功した。 2.血管内皮細胞がパターン化された細胞シートの構築 磁力を用いた細胞のパターニング技術を基盤にして、血管内皮細胞を含む細胞シートの構簗法の検討を行った。具体的には、(1)磁力を用いて線維芽細胞シートおよび筋芽細胞シートを作製し、(2)磁石をマイクロパターン化磁石(幅200μm)に取り替えて、細胞シートの上に磁性ナノ粒子で磁気標識した血管内皮細胞を播種した。結果として、それぞれの細胞シート上に、磁石の形状と同様の200μm線状に血管内皮細胞をパターンすることに成功した。このことから、我々の開発した「磁力を用いる細胞の磁気操作法」により、パターン化された血管内皮細胞を含む三次元組織の構築に成功した。 以上の結果より、磁力を用いる細胞の磁気操作法は、ティッシュエンジニアリングにおける有用な技術であると考えられる。 続きを見る