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1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 瞹味構造を持つ基質に対する酸素認識の全体像解明 — Whole Statue of Recognition by Enzyme Toward Substarates with Vague Signals
荻島 正 ; OGISHIMA Tadashi
研究期間: 2001-2002
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概要: (1)基質にはこれまでの研究によりいくつかの認識に重要なアミノ酸残基が存在することが判明している。しかし、それらの切断部位からの距離は、一次構造上では様々である。そこで、蛍光の共鳴エネルギー移動の原理に基づき、酵素および基質を設計して測定したところ、基質中の重要なアミノ酸は基質によらずほぼ同じ距離で酵素中に存在でしていることが判明した。 (2)基質の中にはこれまで明らかにした認識シグナルの一部を持たないものが少なからず存在する。そこでは、このような前駆体をより切断に有利になるようなアミノ酸に置換した。その結果、基質は変異を加えなくとも切断されたが、アミノ酸置換により切断効率の向上が見られた。これらの結果は、酵素側が認識シグナルの中から最適な組み合わせを選ぶため、基質は認識シグナルの全てを持たなくとも良いことを意味した。 (3)これまでに明らかになったミトコンドリアプロセシングペプチダーゼの基質は、延長ペプチドが10から50残基のアミノ酸からなるものである。前駆体はアミノ末端からミトコンドリアマトリクスに入るため、延長ペプチドは膜透過後に切れる。このため、延長ペプチドは高次構造をとらず、切断点も露出しているものと予想された。しかし、植物には二種のタンパク質の融合前駆体として合成され、ミトコンドリアマトリクスに移入後、機能タンパク質が切り出されるものが存在する。そこで、この反応を解析したところ、プロセシングはミトコンドリアプロセシングペプチダーゼでなされることが判明した。さらに、切断を受けるのが二種のタンパク質が構造をとる前か後かを調べたところ、酵素切断は構造形成の後でも行われるが、切断部位は堅固な構造をとっていないことが判明した。 (4)最近得られた酵素と基質のX-線結晶解析によって基質の切断部位付近の基質-酵素相互作用は明らかになった。しかし、他の重要な認識部位に関しては不明のままである。そこで、蛍光共鳴エネルギー移動法を用いて切断部位からの距離を算出し、X-線結晶解析の結果と合わせ、位置を推定しようと試みた。その結果、基質の切断部位からカルボキシ末端側に約10残基下った領域で、基質は酵素の空洞から出ることが予想された。 続きを見る
2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミトコンドリアにおける前駆体プロセシングの分子構造
伊藤 明夫
研究期間: 1999
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概要: ミトコンドリアにおける前駆体タンパク質のプロセシング反応を解明するため、前駆体とペプチダーゼとの特異的分子認識や切断位置決定に関与する双方の構造要素とそれらの相互作用、活性部位の構造、反応機構を解析した。 1.いくつかの前駆体タンパク質の延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換したペプチドを化学合成し、これらを用いてペプチダーゼとの親和性や切断(水解)反応速度を定量的に解析した。本年は特に、切断位置よりカルボキシ末端側の2位、3位、及び4位のアミノ酸について解析した。これらの位置には親水性、とくにセリン、スレオニン等の水酸基を持つアミノ酸の存在が切断反応そのものに(kcat)に重要であることを示した。 2.蛍光標識ペプチド基質と精製酵素との相互作用の解析から、延長ペプチド中の近位および遠位アルギニンはその距離が5-10アミノ酸離れていても、酵素内の同じ位置に結合していることを示し、その間に存在するグリシンによるペプチド鎖のフレキシビリティの重要性を示唆した。 リケッチア遺伝子ライブラリーからプロセシングプロテアーゼホモローグの遺伝子をクローニングし、大腸菌においてタンパク質を発現させた。タンパク質は金属イオン依存症のプロテアーゼ活性をモノマーの状態で有していた。切断点のアミノ酸要求性は異なるが切断点から離れた位置のアミノ酸が関与している点で真核細胞ミトコンドリアのものと似ており、祖先分子の可能性が示唆された。 続きを見る
3.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミトコンドリアにおける前駆体プロセシングの分子機構
伊藤 明夫
研究期間: 1997
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概要: ミトコンドリアに輸送された前駆体蛋白質の延長ペプチドを切断除去法(プロセシング)し、成熟体にするプロセシングペプチダーゼの前駆体認識の機構と構成サブユニットの役割を解明することを目標としている。 本年度は、次の2点について解析した。(1)本酵素により基質として特異的に認識され、特定の位置が切断されるために必要十分な前駆体延長ペプチドの基本構造、(2)本酵素の2つのサブユニット各々の役割と基質結合や活性発現に関与しているアミノ酸の検索。 1.リンゴ酸脱水素酵素およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換した合成ペプチドを用いた解析により、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸が基質として必要な構造であることを提唱してきたが、それらのみを持つペプチドでは切断が見られず、他の必要構造の存在が示唆されていた。今回の解析により、切断位置よりC末端側の2位および3位のアミノ酸(2位はセリン、トレオニン、ヒスチジンなど、3位はトレオニン、セリンなど)も重要な役割を果たしていることを確認した。 2.蛍光プローブを付加したペプチド基質を用いて、酵素タンパク質への結合反応を解析した。酵素へは切断反応のKmとほぼ同様の10^<-7>オーダーの解離定数で結合したが、2つのサブユニット単独には30-50倍の解離定数を示した。また、結合したペプチドによる蛍光の消光実験より、基質が酵素の表面ではなく少し奥に結合していることが示され、両サブユニットが協同して基質結合部位を形成していることが示唆された。 3.2つのサブユニットについての精製変異酵素を用いた解析により、活性中心金属の結合アミノ酸、基質結合に関与すると思われるグルタミン酸、等の同定を行い、基質の切断点付近はβ-、アミノ末端よりはα-サブユニットが関与していることが示唆された。 続きを見る
4.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of C末端アンカータンパク質の細胞内輸送、膜挿入、機能構造形成へのシャペロンの関与
伊藤 明夫
研究期間: 1997
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概要: C末端アンカー型小胞体膜タンパク質(シトクロムb5)およびミトコンドリア外膜タンパク質(モノアミン酸化酵素、外膜シトクロムb5)のターゲット膜への特異的挿入に関与する因子(膜挿入可能な構造を保証する因子)、の検索とそれらの作用機構およびターゲティングシグナルと因子との分子認識機構を解明することを目標としている。 本年度は、次の2点について解析した。 1.シトクロムb5のターゲティングシグナル部と特異的に結合する細胞質タンパク質をシトクロムb5アフィニティクロマトグラフィーにより検索し、35kDおよび100kDの2つのタンパク質が候補として得られた。現在、構造解析のため両者を精製中である。 2.ターゲティングシグナルに見られる「一見共通性のない曖昧な構造を厳密な情報として受け取る」機構の解明のモデル系としてミトコンドリアタンパク質前駆体のプロセシング酵素(ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ)の基質認識機構を酵素と基質の両面から解析した。酵素には数個の基質認識に与る部位があり、基質はそれらに対応する構造のうち、切断部位付近の必須な構造と別の部分の一つ以上の部位に対する構造をもっていればよく、そのことが基質の多様性と酵素の厳密性を与えていることが示唆された。 続きを見る
5.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of プロセシングプロテアーゼによるミトコンドリアタンパク質の延長ペプチド認識構造の解析
荻島 正
研究期間: 1993
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概要: ミトコンドリアプロセシングプロテアーゼによる認識機構を明らかにするために、以下の研究をおこなった。(1)プロテアーゼ反応をリアルタイムで測定できる基質の開発。(2)基質と同様に酵素に結合するが、切断を受けず酵素と安定な複合体を形成する基質類似体の開発 (1)リンゴ酸脱水素酵素の延長ペプチドをモデルとした合成ペプチドが、ミトコンドリアプロセシングプロテアーゼの基質となり正しい位置で切断を受けることを明らかにした。この合成ペプチドを修飾し、アミノ末端に蛍光基を、切断部位をはさんでカルボキシル末端側に消光基を導入した。その結果、蛍光基は延長ペプチド中の遠位のアルギニンよりもアミノ末端側に存在し、消光基はカルボキシル末端側の切断部位、すたわち、P1'から少なくとも3残基は離れていれば切断に伴い蛍光を発することが判明した。この基質は酵素反応をリアルタイムでしかも高感度に測定することを可能にした。この蛍光基質をさまざまに改変することで、基質認識における遠位および近位のアルギニン、P1'位のアミノ酸の重要性が判明した。 (2)リンゴ酸脱水素酵素の延長ペプチド中のP1'位のアミノ酸をL-フェニルアラニンからD-フェニルアラニンへと置換させた。この基質類似体はプロテアーゼにより切断を受けなくなるばかりか、もとのペプチドやin vitroで合成した前駆体タンパク質の切断をも強く阻害した。この基質類似体を用いて酵素の部位特異的標識化などへの応用を現在準備している。 続きを見る
6.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 寄生原生生物由来のオルガネラにおける前駆体蛋白質のプロセシングの分子機構 — Molecular mechanism of processing of precursor proteins in organelles derived from parasitic organisms
伊藤 明夫 ; ITO Akio
研究期間: 1998-2000
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概要: 寄生原核生物に由来し、進化的に関連あるオルガネラのプロセシングにおける前駆体とペプチダーゼとの特異的分子認識や切断位置決定に関与する双方の構造要素とそれらの相互作用、活性部位の構造、反応機構を理解することを目標とした。 1.ミトコンドリア a.いくつかの前駆体タンパク質の延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換した合成ペプチドを用いてペプチダーゼとの親和性や切断(氷解)反応速度を定量的に解析した。本研究では特に、切断位置よりカルボキシ末端側の2位、3位、及び4位のアミノ酸について解析した。これらの位置には親水性、とくにセリン、スレオニン等の水酸基を持つアミノ酸の存在が切断反応そのものに(kcat)に重要であることを示した。 b.蛍光標識ペプチド基質と精製酵素との相互作用(蛍光エネルギー移動効率)の解析から、延長ペプチド中の近位および遠位アルギニンはその距離が5-10アミノ酸離れていてもこれらをを介して、酵素内の同じ位置に結合していることを示し、その間に存在するグリシンによるペプチド鎖のフレキシビリティの重要性を示唆した。 c.酵素と前駆体との変異蛋白質の解析から、近位アルギニンの結合相手と考えられる酵素側のグルタミン酸残基を同定した。 d.酵素及び酵素と基質ペプチド複合体の結晶構造解析を行い、高次構造を決定した。複合体の構造は上記b及びcの結果を説明するものであり、構造と機能から一致した結果が得られた。 2.原生動物 リケッチアおよびトリパノソーマ遺伝子からプロゼシングプロテアーゼホモローグの遺伝子をクローニングし、大腸菌においてタンパク質を発現させた。前者では金属イオン依存性のプロテアーゼ活性をモノマーの状態で有していたが、後者では。ベータサブユニットホモローグは活性部位構造を持つにも関わらず単独では活性を示さず、酵母等と同じ性質を示し、本酵素は進化のかなり早い時期に現在の分子の特性ができあがったことが示唆された。 3.クロロプラスト シロイヌナズナ葉緑体プロセシングプロテアーゼのcDNAクローニングを行った。 続きを見る
7.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミトコンドリアにおける前駆体プロセシングの分子機構
伊藤 明夫
研究期間: 1998
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概要: 寄生原核生物に由来し、進化的に関連あるオルガネラのプロセシングにおける前駆体とベプチダーゼとの特異的分子認識や切断位置決定に関与する双方の構造要素とそれらの相互作用、活性部位の構造、反応機構を理解することを目標としている。 本年度は、ミトコンドリアとヒドロゲノソームに焦点を合わせ、ミトコンドリアに関してはプロセシングペプチダーゼの前駆体認識の機構を前駆体と酵素の両側から解析した。一方、ヒドロゲノソームに関しては酵素本体のcDNAクローニングを試みた。 1. いくつかの前駆体タンパク質の延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換したペプチドを化学合成し、これらを用いてペプチダーゼとの親和性や切断(水解)反応速度を定量的に解析し、基質として要求される構造として、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸以外に、切断位置よりC末端側の2位および3位のアミノ酸も重要な役割を果していることを確認した。 2. 蛍光標識ペプチド基質と精製酵素との相互作用の解析から、高親和性の基質結合には2つのサブユニットの複合体形成が必須であり、複合体中の奥まったところに結合する。サブユニット単独でも親和性は低いが結合し、それぞれ、基質中の近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸に対する特異性が見られた。 3. 変異酵素の基質認識と切断反応を解析し、基質結合に関与すると思われる酸性アミノ酸群の同定を行った。基質の切断点付近はβ-、アミノ末端よりはα-サブユニットの酸性アミノ酸が関与していることが示唆された。 4. 2つのサブユニットのそれぞれについて、生物種間でホモロジーの高い部分をPCRプライマーとしてTrichomonasおよびTripanosomaのcDNAあるいは遺伝子ライブラリーからプロセシングプロテアーゼホモローグのcDNAクローニングを試みた。後者からβ-サブユニットの相当する部分cDNAが得られた。 続きを見る
8.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ系における基質および基質認識構造の解析 — Analysis for the Substrate Strucure and Structure Responsible for Substrate-recognition by Mitochondrial Processing Peptidase
荻島 正 ; OGISHIMA Tadashi
研究期間: 1995-1996
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概要: リンゴ酸脱水素酵素(MDH)の延長ペプチドをモデルとした合成ペプチドに自己消光性の蛍光基を導入することで、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ(MPP)の反応をリアルタイムで簡便に測定するのに成功した。他のミトコンドリアタンパク質前駆体の延長ペプチドをモデルとした基質についても解析を行い、それらにおいても、MDHと同様の認識シグナルが働いていることを明らかにした。MDHにおいては、延長ペプチド部分の近位と遠位アルギニンの間には柔軟な構造が不可欠であることを、主鎖にエーテル基を導入したアミノ酸をその部分に入れることで証明した。さらに、アルギニンのアナログアミノ酸を用いることで、近位アルギニンの認識には側鎖の2カ所の水素結合とイオン結合が関与していることを明らかにした。以上のような認識要素は実際の前駆体タンパク質でも機能していることを明らかにした。 点変異法によりβ-サブユニットに触媒部位があることを明らかにした。αおよびβ-サブユニットを大腸菌で大量発現させる系を確立し、これらのサブユニットを高純度に精製し、再構成することに成功した。この再構成系を用いて合成基質による光親和性標識を行ったところ、基質の切断部位付近は触媒部位のあるβ-サブユニットに結合することが判明した。しかし、基質のC-末端部はα-サブユニットと結合することが判明した。すなわち、これらのことは、両サブユニットが共同で基質認識部位を形成していることを強く示唆している。 続きを見る
9.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼの基質認識と反応の機構
伊藤 明夫
研究期間: 1996
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概要: ミトコンドリアに輸送された前駆体蛋白質の延長ペプチドを切断除去(プロセシング)し、成熟体にするプロセシングペプチダーゼの前駆体認識の機構と構成サブユニットの役割を解明することを目標としている。 本年度は、次の2点について解析した。(1)本酵素により基質として特異的に認識され、特定の位置が切断されるために必要十分な前駆体延長ペプチドの基本構造、(2)本酵素の2つのサブユニット各々の役割と基質結合や活性発現に関与しているアミノ酸の検索。 1.リンゴ酸脱水素酵素およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換したペプチドを化学合成し、これらを用いてペプチダーゼとの親和性や切断(水解)反応速度を定量的に解析し、基質として要求される構造として、切断位置よりC末端側も関与していることが分かった。 2.これまで合成ペプチドを用いた解析により、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸の重要性が示唆されていたが、前駆体全体を用いても同様の要求性があることを確認した。 3.2つのサブユニットのcDNAの特定部位あるいはランダムに変異を与え、アドレノドキシン前駆体との共発現系を用いて変異酵素のスクリーニングを行った。変異酵素の基質認識と切断反応を解析し、酵素の活性中心金属の結合アミノ酸、基質結合に関与すると思われる酸性アミノ酸群、等の同定を行った。 4.酵母の2つのサブユニットのクローニングを行った。酵母とほ乳動物のサブユニットを大腸菌で発現させ、両者の安定なハイブリド酵素を作ることにより、これまで不安定で精製が困難であった酵素の精製を可能にした。 続きを見る
10.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ATP加水分解共役型排出ポンプの分子構造と機能制御 — Molecular structure and functional regulation of ATP-binding cassette transporters
和田 守正 ; WADA Morimasa
研究期間: 2001-2005
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概要: ATP加水分解共役型排出ポンプの構造に基づく機能制御を明らかにし、その破綻による疾病の病態解析を行う事を目的に、以下の実績を上げた。 【1】基質認識機構:ABC膜タンパク質ファミリー間でのキメラタンパク質を構築し解析した結果、基質親和性の決定には、基質結合部位そのものではなく、N端のMSD1ドメインが関与していることを明らかにした。さらに、MSD1が基質結合そのものに関与するか否かを光親和性ラベル法により明らかにするための構築体作製と発現条件の最適化を終了した。 【2】細胞内の仕分け局在機構:ABC膜タンパク質の形質膜へのアンカリングには、PDZドメインタンパク質がC末端に作用することが重要であると報告されている。 しかしながら、apical-basolateralの仕分け機構に関しては全く未解明であった。 本研究では、ABCC1/ABCC2キメラタンパク質の構築と解析により、MSD2(2つ目の膜貫通ドメイン)および周辺領域が関与することを明らかにした。 【3】相互作用タンパク質による機能修飾:酵母ツーハイブリッド法によりABCC2蛋白質の機能修飾蛋白質を検索した。全長cDNAをbaitとして用いて、シャペロンなどの、タンパク質成熟に関与する候補蛋白質を同定し、細胞質ドメインのみからなるbaitを用いて、プロテアソーム構成タンパク質や転写因子を含む機能修飾蛋白質候補を同定した。 【4】生理機能の多様性と機能制御の破綻による疾病の解析:遺伝子欠損マウスモデルの病態解析と九州北部コホートを対象とした大腸がんの症例対照研究によって、ABCB1が腸管腫瘍形成に関与するという予想外の結果を得、ABC膜タンパク質の新しい生理機能として、細胞の増殖と生存における役割を提示した。さらに、分子疫学解析によりABCB1は潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患にも関与しているという結果を得た。 続きを見る