close
1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミトコンドリアのタンパク質輸入装置複合体の構造解析
阪口 雅郎
研究期間: 2001-2002
本文を見る:
概要: ミトコンドリアには外膜・内膜それぞれにタンパク質膜透過装置すなわち「tom(translocase of outer membrane)-複合体」および「Tim(Translocase of inner membrane)-複合体」が存在する。本研究はミトコンドリアへのタンパク質輸入に関わる各複合体因子の構造を明らかにし、さらに内膜・外膜のタンパク質輸入装置の構造を解明し、ミトコンドリアへのタンパク質輸入というダイナミックな生命現象を原始レベルで解明することを目的とする。本年度は、Tom-複合体のなかで透過チャネルを構成する中心成分であるTom40の解析を中心に進め以下の成果を得た。 (1)大腸菌で発現し、封入体として高度に精製し、変性剤によって可溶化後、Ni-カラムに結合させその後カラム樹脂上で変性剤から界両活性剤に置き換えることによって立体構造を再生できた。(2)リポソームに再構成したTom40はカチオン選択性のチャネル活性を示し、この活性はミトコンドリア標的化プレ配列ペプチドで阻害されることがわかった。(3)電子顕微鏡では、内直径3nmのリング状構造が観察された。(4)マトリクスへ標的化される前駆体タンパク質を特異的に認識・結合することが、抗体を用いた共沈殿の実験や表面プラズモン共鳴の実験で明らかになった。また、この結合は静電的なものであることが判明した。(5)Tom40に結合した前駆体タンパク質はプロテアーゼに耐性となり、リング状構造の内側にまで進入して結合していることが示唆された。(6)Tom40単独および前駆体タンパク質(Su9-DHFR)との複合体の結晶化条件を検討中である。 続きを見る
2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 膜タンパク質の局在およびトポロジー形成原理の網羅的解明とデータベースの構築
阪口 雅郎
研究期間: 2002
本文を見る:
概要: 本研究では小胞体における膜蛋白質の構造形成機構ならびにミトコンドリア外膜への特異的標的化シグナル配列について探求した。進展内容は以下のとおりである:(1)小胞体では膜組み込み特性の強いセグメントによって、膜に組み込まれる特性のないポリペプチドセグメントが膜貫通配置を取るという我々のモデルを、いくつかの実例でさらに実証し、膜貫通セグメントの「他律的配置(autonomous positioning)」と命名した(Sakaguchi,BBRC,2002;Ukajiら,BBRC,2002)。タンパク質のフォールディングにおいて、他のセグメントの立体配置決定によって特定のセグメントの配置が他律的に決定されてしまうことを明確に示したものである。(2)膜貫通セグメントが他のセグメントと極性または電荷間相互作用することによって膜内に組み込まれることを2例(ヒト赤血球バンド3および植物カリウムイオンチャネル)について実証した(Kankiら,Biochemistry,2002;SatoらPNAS,2002;Satoら,JBC,2003)。これで、疎水性セグメントが自発的に組み込まれるモード、疎水性の不十分なセグメントが他の疎水性セグメントの組み込みに伴って強制的に組み込まれるモード、および極性相互作用による膜組み込みモード、のすべてを実験的に示すことが完了した。(3)膜蛋白質が、小胞体への標的化を回避してミトコンドリア外膜に到達するためのシグナルを、カルボキシル末端に膜結合セグメントを持つTom5について確定した(Horieら、Mol.Biol Cell,2002)。膜貫通ヤグメントが長すぎず適度な疎水性度を有することと、膜貫通セグメント直後に正荷電アミノ酸が存在することが必須である。 続きを見る
3.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 膜タンパク質のオルガネラ標的化とトポロジー形成の分子機構 — Mechanism of organelle targeting and topogenesis of membrane proteins
阪口 雅郎 ; SAKAGUCHI Masao
研究期間: 2002-2004
本文を見る:
概要: 本研究では、これまでに明らかにした小胞体への膜タンパク質の組み込み様式をもとに、いくつかの代表的なマルチスパン膜蛋白質のすべての膜貫通セグメントの膜内配置機構を徹底的に解析した。アミノ末端側を膜透過させる1型シグナルアンカー配列が、予想外に長いドメインを膜透過できることを明らかにし、その際に、燐酸高エネルギー化合物や小胞体内腔の熱ショックタンパク質(hsp70,BiP)は関与せず、リボソームが膜透過自体に寄与し、膜透過の駆動力が初期段階とその後の連続的段階とで異なることを明らかにした。また、われわれが明らかにしてきた「内在性シグナルアンカー配列による他律的な低疎水性セグメントの膜組み込みモデル」を支持する、新たな事例を見出した。並行して、疎水性度の高い膜蛋白質が小胞体への標的化を回避し、ミトコンドリアやペルオキシソームなどの分泌経路以外のオルガネラに標的化するためのシグナル配列を解析し、膜蛋白質に特化したミトコンドリア標的化シグナルを明らかにした。このシグナルは小胞体への合成に共役した標的化を抑制し、ミトコンドリアへの合成後の輸入を実現するものであった。さらに、ミトコンドリア外膜の膜貫通蛋白質TOM22のトポロジー形成シグナルを明らかにした。またミトコンドリア蛋白質膜透過チャネルを形成するTOM40の大量発現、精製、再生系を確立し、低分子透過活性のあること、ミトコンドリアシグナルを認識し、分子の奥深くにそれを収納することを明らかにした。 続きを見る
4.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 7回膜貫通型膜タンパク質の合成に共役した構造形成過程の解明
阪口 雅郎
研究期間: 2001-2002
本文を見る:
概要: 本研究では、小胞体における膜蛋白質の構造形成機構について探求した。進展内容は以下のとおりである:(1)小胞体では膜組み込み特性の強いセグメントによって、膜に組み込まれる特性のないポリペプチドセグメントが膜貫通配置を取るというわれわれのモデルを、いくつかの実例でさらに実証し、膜貫通セグメントの「他律的配置(autonomous positioning)」と命名した(Sakaguchi, BBRC,2002;Ukajiら,BBRC,2002)。タンパク質のフォールディングにおいて、他のセグメントの立体配置決定によって特定のセグメントの配置が他律的に決定されてしまうことを明確に示したものである。(2)膜貫通セグメントが他のセグメントと極性または電荷間相互作用することによって膜内に組み込まれることを、2例(ヒト赤血球バンド3および植物カリウムイオンチャネル)について実証した(Kankiら,Biochemistry,2002;SatoらPNAS,2002;Satoら,JBC,2003)。これで、疎水性セグメントが自発的に組み込まれるモード、疎水性の不十分なセグメントが他の疎水性セグメントの組み込みに伴って強制的に組み込まれるモード、および極性相互作用による膜組み込みモードの全てを実験的に示すことが完了した。(3)本研究の主題であるロドプシンについては、培養細胞での3種の発現条件を設定し培養細胞系で発現させることに成功した。最も発現量の多かったCOS細胞とCMVプロモーターの組み合わせでも、発現したタンパク質の大半がN-結合型糖鎖付加を受けていることがわかった。この系を用いて各ヘリックス間パッキングをモニターすることとした。(4)ついで、2箇所にシステインを導入した変異ロドプシンの系統的な作成にとりかかっている。ジスルフィド結合形成による電気泳動上の移動度の差をモニターする系を作成中である。 続きを見る
5.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 属性の創造と探索によるDNAシグナル配列発見方式の研究
丸山 修
研究期間: 2001-2002
本文を見る:
概要: 本研究の目的は,属性創造と属性空間の探索により,シグナル配列発見問題を解決することである.本年度は,シグナル配列を捉える個々のパターンを属性と捉え,これらの包含関係に着目し,様々なパターンからなる巨大探索空間を効率よく探索する枝刈り探索アルゴリズムを開発・実装した.また,計算機実験による手法の有効性の検証を行った. 問題の定式化と計算量: シグナル配列の特徴を表すパターンモデルの一つにIUPAC核酸コード上の文字列があげられる.本研究では,これをdegenerate patternとしてフォーマルに定式化し,与えられた配列データセットに対する最適degenerate patternを見つける計算問題がNP-完全であることを明らかにした. 属性空間の探索: degenerate patternが定義する言語の包含関係から得られるパターンの評価値の上限に関する特徴付けを利用したdegenerate patternのための枝刈りアルゴリズムを開発した. 計算機実験: 開発した手法の有効性を合成データと実データを用いて既存手法との比較実験を行った.実データを用いた実験においては,yeastのデータベースSCPD(the promoter database of Saccharomyces cerevisiae, http://cgsigma.cshl.org/jian/)に登録されている既知のシグナル配列の検出率を基準とした.これにより,多くの既知配列に対して手法の有効性が確認された. また,以上の研究の発展として,これらパターンを基礎の属性とする帰納的仮説モデル(例えば,決定木や論理式など)が与える甚大な探索空間を効率よく探索するための基礎理論を構築する研究にも着手した.そこでは,仮説モデル間の類似度を与えるメジャーを定式化し,代表的な帰納的仮説モデル間の類似度を解析することに成功している. 続きを見る
6.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of イオンチャネルの膜内への組み込み機構の解明
佐藤 陽子
研究期間: 2003-2005
本文を見る:
概要: ナトリウムイオン・プロトン交換輸送体(NHE/NHXファミリー)およびShaker型カリウムイオンチャネルは、動物の遺伝病や植物の耐塩性に関与する膜タンパク質として機能の解析が盛んに行われている。しかし、その構造形成過程には不明な点が多いため、本研究において解明を試み以下のような知見を得た。 1 シロイヌナズナNHX1とヒトNHE1は、アミノ酸配列が類似しているにもかかわらず異なる膜貫通構造(トポロジー)モデルが提唱されていた。我々はトポロジーモデルの検証実験を行い、これらのトポロジーが同一であることを示した。また、シグナルペプチドの有無によるトポロジー形成過程の違いも明らかにした(佐藤ら、JB(Tokyo)2005)。 2 Shaker型カリウムイオンチャネルは、カリウムイオンチャネル本体部位と多くの親水性残基を含む膜電位センサー部位が融合した構造を持っている。我々はシロイヌナズナ由来Shaker型カリウムイオンチャネルの構造形成過程を詳細に調べ、膜電位センサー部位が特殊な構造形成過程を経ることをすでに明らかにしている(佐藤ら、PNAS2002、BBB2003およびJBC2003)。今回は、Shaker型カリウムイオンチャネルの中でも最も研究が進んでいるショウジョウバエShaker Bチャネルを用いて、カリウムイオンチャネル構造形成における普遍的特長を解明することを試みた(張ら、投稿準備中)。 3 単純なアミノ酸で構成される人口膜タンパク質を用いて、電荷残基の位置のトポロジー形成への影響を調べ、側鎖の長い電荷残基は膜貫通部位の内部にも安定して存在しうることを明らかにした。この結果を輸送体やチャネルなど生体膜タンパク質の解析に応用したいと考えている。 続きを見る
7.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 膜蛋白質の局在及びトポロジー形成原理の解明 — Mechanism of organelle targeting and topogenesis of membrane proteins
阪口 雅郎 ; SAKAGUCHI Masao
研究期間: 2003-2004
本文を見る:
概要: 蛋白質の細胞内局在と膜内構造形成の原理を解明することによって、ゲノムがコードするすべての膜蛋白質の立体構造、細胞内局在および生物機能の予測法の確立に貢献することを目的とした。これまでに明らかにした蛋白質の膜への組み込み様式をもとに、いくつかの代表的なマルチスパン膜蛋白質のすべての膜貫通セグメントの膜内配置機構を徹底的に解析した。アミノ末端側を膜透過させる1型シグナルアンカー配列が、予想外に長いドメインを膜透過できることを明らかにし、その際に、燐酸高エネルギー化合物や小胞体内腔の熱ショックタンパク質(hsp70,Bip)が関与せず、リボソームが膜透過自体に寄与し、膜透過の駆動力が初期過程とその後の連続的過程とで異なることを明らかにした。また、ゲノム情報科学解析を基にして提案された、低疎水性セグメントの新たな組み込み様式を、モデル蛋白質を使って検討し、妥当性を検証できた。並行して、疎水性度の高い膜蛋白質が小胞体への標的化を回避し、ミトコンドリアやペルオキシソームなどの分泌経路以外のオルガネラに標的化するためのシグナル配列を解析し、膜蛋白質に特化したミトコンドリア標的化シグナルを明らかにした。このシグナルは小胞体への合成に共役した標的化を抑制し、ミトコンドリアへの合成後の輸入を実現するものであった。さらに、ミトコンドリア外膜の膜貫通蛋白質TOM22のトポロジー形成シグナルを明らかにし、またミトコンドリア蛋白質膜透過チャネルを形成するTOM40の大量発現、精製、再生系を確立し、ミトコンドリア認識シグナルの機能解析への道を開いた。 続きを見る
8.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 小胞体における蛋白質膜透過の一分子観察
阪口 雅郎
研究期間: 2004-2005
本文を見る:
概要: 真核細胞の小胞体では、さまざまな蛋白質が膜を透過し、膜蛋白質が膜に組み込まれている。このダイナミックなプロセスにはトランスロコンと呼ばれるポリペプチド鎖膜透過チャネルが関わっている。トランスロコンはきわめて多種類の蛋白質ポリペプチド鎖を容易に膜透過させるという驚異的な作用をもつ。本研究は小胞体トランスロコンにおけるポリペプチド鎖の移動透過過程を一分子レベルで観察し、透過の経時変化、移動速度、移動頻度、方向性などを測定可能とすることを目指した。高純度で高い蛋白質膜透過活性を有する小胞体膜標品の取得、ウサギ網状赤血球溶血液を用いた高効率タンパク質合成系の大量調整を行った。さらに、われわれの発見した1型シグナルアンカー配列のアミノ末端側にジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)ドメインを融合した場合、高効率で膜透過できること、この透過が特異リガンドであるメトトレキセートを添加することによって完全に抑制されること、このリガンドを除去することによって高効率で膜透過を再開できること、この過程には熱ショック関連蛋白質や燐酸高エネルギー化合物は不要なことを明らかにした。さらに、より制御しやすいポリペプチド鎖膜透過制御実験系を確立し、小胞体トランスロコン内には複数のシグナル配列と複数の親水性膜透過途上セグメントが収容されること、膜透過制御要因であるポリペプチド鎖上の正荷電アミノ酸残基が予想外に長距離での効果を発揮できことなどを明らかにしつつある。 続きを見る
9.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ミトコンドリアのタンパク質輸入装置複合体の構造解析
坂口 雅郎
研究期間: 1999-2000
本文を見る:
概要: ミトコンドリアには外膜・内膜にタンパク質の輸入に関るタンパク質膜透過装置すなわち、"Tom(translocase of outer membrane)-複合体"および"Tim(Translocase of inner membrane)-複合体"が存在している。本研究はTom構成因子の構造を明らかにすることを目標とした。 Tom-複合体のタグ標識した遺伝子改変酵母からの調製は、複合体が酵母細胞破砕や抽出の過程で極めて不安定であることが判明したため中止した。次いで、哺乳動物(ラット)肝臓のミトコンドリアからの調製に切り替えた。単離したミトコンドリアからの抽出・精製条件の検討と、得られる複合体の特性解析を行った。われわれが取得している因子のなかで、Tom20・Tom22・Tom40がラット複合体中に含まれていることが確かめられた。この複合体の大量調製条件を検討している。並行してTomの中心的成分であるTom40について大腸菌内での発現・精製の条件検討をおこなった。ラットのcDNAを発現すると大腸菌では封入体となった。可溶化条件の設定、精製と再生の条件設定が完了し、すでに大量の精製標品を得ている。得られた変性可溶化・再生されたTom40は、強い超遠心でも沈降することはなく、さらに光散乱実験から非常に均一な分散状態であることが明らかとなった。また膜タンパク質の場合、溶液の界面活性剤の置換やタンパク質の濃縮が技術的に煩雑になるが、小スケールのイオン交換カラムを使用することで簡便に界面活性剤の種類・濃度等の変更を行えるように工夫し、安定化や分散状態の至適化ために条件探索をおこなっている。現在、詳細な結晶化条件の検索中である。 続きを見る
10.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 膜蛋白質のトポロジー形成機構と構造予測
阪口 雅郎
研究期間: 1997
本文を見る:
概要: 【1】正電荷によるマルチスパン型膜蛋白質のトポロジー制御 4本の疎水セグメントをもつモデル蛋白質を構築しそれらのトポロジーを、粗面小胞体膜を添加した試験管内発現系を用いて解析した。その結果:(1)マルチスパン膜蛋白質においても正電荷によって膜内配向性が制御されていること、(2)正電荷の分布によっては疎水性配列がすべて組み込まれず、特定の疎水セグメントが膜外に配置される場合があることを明らかにした。 【3】マルチスパン膜蛋白質、赤血球 Band3、の立体構造形成機構の解明 赤血球のBand3蛋白質は14本の膜貫通セグメントを有する典型的なマルチスパン型膜蛋白質である。このような複雑な膜内トポロジーを示す膜蛋白質のトポロジー(立体構造)形成の機構を明らかにするために、まずそれぞれのセグメント単独での膜透過再開機能と膜透過停止機能を評価し、膜内でのトポロジー形成機構との関連を調べた。その結果、単独では膜との相互作用が不十分であり組み込みに積極的な寄与が期待できないセグメントをいくつか明らかにした。これらのセグメントの組み込みには、膜内での構造形成の過程において膜貫通配列間の相互作用が必要であることが明らかになった。さらに、蛋白質合成に共役した組み込みにおいて、よりカルボキシル末端側にあるセグメントの機能によってそのアミノ末端側のセグメントが組み込まれる過程のあることを明らかにし、この知見をもとに疎水性度の低いセグメントの組み込みモデルを提唱した。 続きを見る