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1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 肝臓における急性相反応性蛋白生合成調節機構の解析
石橋 大海
研究期間: 1983-1984
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2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 血漿糖タンパクの生合成調節機序の解析
石橋 大海
研究期間: 1980
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3.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 原発性胆汁性肝硬変における免疫制御の分子機構 — MOLECULAR MECHANISM OF IMMUNE REGULATION IN PRIMARY BILIARY CIRRHOSIS
石橋 大海 ; ISHIBASHI Hiromi
研究期間: 1996-1997
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概要: 1)ミトコンドリア抗原のB細胞エピトープ・マッピング PBC患者から得た抗ミトコンドリア抗体を使用し,主要ミトコンドリア抗原であるPDC-E2のB細胞エピトープ・マッピングを行った.エピトープは外側(Lys-46)および内側(Lys-173)リポ酸ドメインのリポ酸を結合したLysineを中心とした領域にマップされた.それぞれN側に存在するAspが抗体との反応にとって重要であった.リポ酸を離断し,さらに再結合して,抗体のPDC-E2抗原との結合に対するリポ酸の影響をみたが,抗体の反応には影響しなかった. 2)ミトコンドリア抗原に対するT細胞クローンの樹立 各HLAを有するPBC患者末梢血より,ミトコンドリア抗原特異的T細胞株あるいはクローンを樹立し,それぞれのエピトープを決定した.T細胞クローンの樹立は,抗原提示細胞を各種ミトコンドリア抗原(PDC,合成ペプチド)の存在下で培養し,ミトコンドリア抗原の刺激を繰り返すことにより行った.その結果,PBC患者および健常人の末梢血よりPDC E2コンポーネントの163-176ペプチド(PDC-E2 163-176)を,HLADR53拘束性に認識するT細胞クローンの樹立に成功した.また,HLADR53以外のMHC classII分子に拘束されるPDC-E2反応性T細胞のエピトープ解析を行った結果,PDC-E2 341-360,355-374,373-392,392-411,449-466ペプチドに反応するTcell lineの樹立に成功した. 3)T細胞エピトープおよびHLA拘束性の同定-PBCにおけるT細胞の認識機構の解析 PDC-E2 163-176反応性T細胞の出現頻度がPBC患者で有意に高いことより,これらのT細胞はPBCの病態に関与していると考えられた.またこれらのT細胞はCD4陽性でThl様タイプであった.これらのT細胞クローンのT細胞レセプターのβ鎖を解析した結果,超可変領域CDR3はGXG,GXS,RGXGという限られたモチーフが使用されていることが明らかになった. 4)蛋白工学的に修飾したペプチドアナログを用いた免疫応答の制御 同定したエピトープのTCR認識部位やMHC結合部位の情報をもとに蛋白工学的に修飾したベプチドを用いてPBCに対する抗原特異的免疫療法の開発をめざした.EXDK配列を有する他の抗原ペプチドの中にPDC-E2ペプチド特異的T細胞が反応する外来抗原ペプチドが6種類存在した.さらにmimicryペプチドに特異的なT細胞が自己反応性PDC-E2ベプチド特異的T細胞の活性化を抑制し,自己免疫反応を調節している可能性が推察された. 本研究で得られた成果より,PBCの発症に関与する病因エピトープと自己抗原認識機構の一端が分子レベルで明らかになり,他のヒト自己免疫疾患の病態解析や治療法の開発に有用な情報を提供できるものと思わ 続きを見る
4.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 原発性胆汁性肝硬変症における抗ミトコンドリア抗体産生Bリンパ球レパートリーの解析 — Analysis of Anti-mitochondrial Antibody Producing B Cell Repertoire in Primary Biliary Cirrhosis
石橋 大海 ; ISHIBASHI Hiromi
研究期間: 1991-1992
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概要: 原発性胆汁性肝硬変症(PBC)に特異的に出現する抗ミトコンドリア抗体の対応抗原として明らかになったピルビン酸脱水酵素複合(PDC)、および2-オキソグルタル酸脱水酵素複合体(OGDC)の精製標品を用いて、PBC患者末梢血のBリンパ球レパートリーの解析と球株のクローニングを試み、以下のような成果が得られた。 1.PBC患者血清中の抗PDC、抗OGDDC抗体の免疫グロブリン・クラス別の測定系(ELISA)を確立した。2.ELISAを用いてPBCや他の疾患における患者血清中両抗体の陽性率を検討した結果、いずれもPBCに特異的であった。3.PBC患者末梢血より採取したBリンパ球にEBウィルスを感染後、限界希釈法にて培養し、培養上清中に分泌される抗PDC、抗OGDC抗体をELISAにて測定し、PBC患者末梢血中に存在する両抗体産生Bリンパ球の頻度を算出した結果、IgG産生Bリンパ球の0-2%の頻度であった。4.抗PDC、抗OGDC抗体産生Bリンパ球頻度を患者血清中の両抗体の抗体価や肝の病理組織所見と比較検討した結果、肝組織浸潤リンパ球の程度と相関し、疾患の活動性を表わすことが示唆された。5.抗PDC抗OGC抗体産生EBV-transformed cell lineを樹立し、さらにF3B6cellと細胞融合することにより、計3個の安定したヒト型抗PDC抗体産生株、1個の抗OGDC抗体産生株を樹立した。6.得られたモノクローナル抗体の性状を検討した。それぞれPDCのE2、X蛋白、OGDCのE2と特異的に反応し、invitroにてそれぞれの酵素活性を抑制した。7.エピトープと考えられるPDC-E2上のリポ酸結合ドメインの合成ペプチドを作製し、エピトープ領域を推定した結果、E2上に少なくとも2個のエピトープが存在することを明らかにした。 続きを見る
5.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 原発性胆汁性肝硬変における免疫応答の解析 — ANALYSIS OF IMMUNE RESPONSE IN PRIMARY BILIARY CIRRHOSIS
石橋 大海 ; ISHIBASHI Hiromi
研究期間: 1994-1995
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概要: 1.抗ミトコンドリア(PDC)抗体遺伝子の決定ならびに抗体産生Bリンパ球の由来の解析 PBC患者より樹立した抗ミトコンドリア(PDC, OGDC)抗体産生B細胞株よりmRNAを精製し, cDNAを作成した.このcDNAより免疫グロブリンIgV geneに特異的なprimerを用いてIg遺伝子をPCR法を用いて増幅後,増幅されたIg遺伝子をplasmid vectorにクローニングし,その塩基配列を決定し,既知の免疫グロブリン遺伝子ファミリーと比較した.その結果,抗ミトコンドリア(PDC, OGDC)抗体に特異的な遺伝子ファミリーの使用はなく,抗原で刺激されたBリンパ球がクローナルに増殖した可能性を明らかにした. 2.自己抗原(PDC-E2)特異的T細胞のクローニングとT細胞エピトープの解析 PBC患者末梢血を自己抗原提示細胞と各種ミトコンドリア抗原(PDC, OGDCおよびPDC-E2コンポーネントを網羅する合成ペプチド)の存在下で培養し,ミトコンドリア抗原で刺激を繰り返すことによってミトコンドリア抗原特異的T細胞クローンを樹立した.得られたT細胞クローンについてT細胞エピトープ・マッピングを行った.その結果,T細胞エピトープもBリンパ球の近傍に存在し, minimmum epitopeはペプチドPDC-E2 (163-176)であることを明らかにした.このT細胞エピトープの各々のアミノ酸を他のアミノ酸と置換したペプチドでT細胞クローンを刺激することにより, EXDK配列がMHCあるいはT細胞レセプターとの結合に必須の部位であることを明らかにした.さらに,T細胞クローンのひとつが大腸菌のPDC-E2に反応したことにより,T細胞による認識においてもmolecular mimicryが存在し, PBCの発症にも大腸菌が関与している可能性があることを初めて明らかにした. PBC患者のHLAの検索 PBC患者48名のHLA-DR, DQ, DP座位を336の健常者を対照として,SSOP法によってDNAタイピングを行った.その結果, PBCの疾患感受性はHLA-DRB1 locusによって,一方, PBCへの疾患抵抗性はHLA-DQ locusによって制御されている可能性を明らかにした. 続きを見る
6.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 肝細胞癌に対するMAGE-1遺伝子産物ターゲットとした特異的免疫療法
林田 一洋 ; 石橋 大海
研究期間: 1999-2001
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概要: 【背景・目的】 われわれは,肝細胞癌に高率(80%)にMAGE-1遺伝子の発現がみられることを報告した.本研究の目的は,MAGE遺伝子産物をターゲットとした肝細胞癌特異的な免疫療法の臨床応用が可能であるかどうか検討するものである. 【方法・結果】 肝切除術が施行された原発性肝癌症例を対象とし,腫瘍組織よりmRNAを抽出し,β-actinの発現を確認した後,異なるExon間にPrimerを設定し,RT-PCR法によりMAGE-1,2,3遺伝子の発現を観察した.また,肝臓由来の細胞株でも同様の検討を行った.肝癌組織で高率にMAGE-1および-3遺伝子の発現が確認された.切除肝あるいは生検肝を用い,免疫組織学的方法によりMAGE遺伝子産物の発現の検討を行っている. 抗原特異的免疫療法を行うためには,MAGE-1蛋白のT細胞エピトープを明らかにし,エピトープペプチドによるその反応性を検討することが重要である.MAGE-1蛋白のエピトープは、現在のところHLAA1でしか明らかにされていないため,別に研究を進めている原発性胆汁性肝硬変の抗原エピトープ特異的T細胞を用いて,自己抗原エパトープ・ペプチドのアナログペプチドに対するT細胞応答性を解析中である. 【今後の計画】 患者と同一のHLA classI抗原を有した細胞株にMAGE-1遺伝子を導入し,mRNAおよび蛋白レベルでのMAGE-1遺伝子の発現をRT-PCR法およびサザンブロッティング法で確認する.さらに,患者から採取したTリンパ球を,HLA class I matched MAGE-1陽性細胞株をfeederとして培養し,51Crリリース法を用い,feederとして用いた細胞に特異的な細胞障害活性を検討中である.(本研究は13年度途中で研究代表者石橋大海異動のため林田一洋が継続) 続きを見る
7.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 原発性胆汁性肝硬変の病因エピトープの同定と免疫応答の解析 — The analysis of epitope and immunological response of primary biliary cirrhosis
林田 一洋 ; HAYASHIDA Kazuhiro ; 石橋 大海
研究期間: 1999-2001
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概要: 原発性胆汁性肝硬変(PBC)に特異的に出現する抗ミトコンドリア抗体の主要対応抗原はピルビン酸脱水素酵素E2コンポーネント(PDC-E2)である。我々はPBC患者のT細胞エピトープのひとつがHLA-DR53で拘束されるPDC-E2 163-176(163GDLLAEIETDKATI 176)であり,170グルタミン酸(E),172アスパラギン酸(D),173リジン(K)(ExDK配列)がT細胞の認識に重要であり,ヒトPDC-E2 163-176特異的T細胞クローン(hPDC-CC)の一部は大腸菌由来のPDC-E2抗原にも交差反応性を示すことを明らかにしている。 平成11年度 HLA-DR53拘束性hPDC-TCCは全てのTh1様タイプT細胞であった。hPDC-TCCはヒトPDC-E2 163-176ペプチドと分子相同性を示す大腸菌由来ペプチドにのみでなく,他のいくつかの細菌由来ペプチドに対しても反応した。 平成12年度 hPDC-TCCの外来性抗原と自己抗原に対して2つの反応パターンが存在した.一方はミトコンドリア抗原由来ペプチドとのみ反応し,他方は自己抗原以外にもExDKモチーフを有する細菌由来のペプチドとも反応した。 平成13年度 hPDC-TCCの一部は抗核抗体の対応抗原由来ペプチドと交差反応性を有した。また外来抗原である大腸菌OGDC-E2 34-47反応性T細胞クローンの多くは,抗ミトコンドリア抗体の各対応自己抗原ペプチドに対して交差反応性を有した。 以上から,PBCにおいて自己抗原および外来抗原との間に自己反応性T細胞レベルで交差反応性が存在することを証明し,自己に対するトレランスの破綻に分子相同性機序が関与している可能性を推察した。(本研究は13年度途中で研究代表者 石橋大海 異動のため主たる業績は石橋大海による) 続きを見る
8.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 原発性胆汁性肝硬変の病因エピトープの同定と抗原特異的治療法の開発
石橋 大海
研究期間: 1996
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概要: 本研究では,これまでの他の研究施設およびわれわれの研究実績を基に,PBCをヒトの臓器特異的自己免疫疾患のモデルとして取り上げ,PBCに特異的なTCRリガンドの同定,TCRリガンドの発現調節やTCRリガンドによる自己反応性Tリンパ球の活性化機構等その免疫異常の本態を分子レベルで明らかにする.また,MHC結合修飾ペプチドによるTリンパ球の免疫応答の制御,さらには,PBCモデル動物の開発を行い,それを利用して疾患特異的治療法の確立を試みることを目的とした. 本研究の成果として,PBC患者の末梢血中にはHLA-DR53拘束性にヒトPDC-E2ペプチド163-176に反応するT細胞が存在し,EXDKがその認識に重要である,このようなT細胞は健常者に比しPBC患者に有意に多く存在する,またこれらのT細胞はCD4陽性でTh1様タイプであり,EXDK配列を有する他の抗原ペプチドの中にPDC-E2ペプチド特異的T細胞が反応する外来抗原ペプチドが6種類存在する,さらにmolecular mimicryペプチドに特異的なT細胞が自己反応性PDC-E2ペプチド特異的T細胞の活性化を抑制し,自己免疫反応を調節しているという結果を得た.これらの結果より,分子相同性がPBCの病態形成に何らかの関与をもち,エピトープ特異的な免疫制御療法の格好のターゲットになる可能性が考えられた.また,T細胞クローンのTCRを解析した結果,超可変領域CDR3はGXG,GXS,RGXGという限られたモチーフが使用されていることが明らかとなった(Ichiki et al).このことより,CDR3をターゲットとした免疫療法の可能性が得られた. 本研究を通じて,PBCの発症に関与する病因エピトープと自己抗原認識機構の一端が分子レベルで明らかとなり,TCRリガンド特異的免疫制御法の開発の可能性が期待された.また,本研究で得られた知見は,他のヒト自己免疫疾患の病態解析や治療法の開発に有用な情報を提供できるものと思われた. 続きを見る
9.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 肝細胞癌に対する特異的免疫療法
石橋 大海
研究期間: 1996-1997
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概要: 本研究の目的は,癌細胞に特異的に発現されるMAGE遺伝子産物をターゲットとした肝癌特異的な免疫療法の確立をめざすものである. まず,肝臓由来の7種類の細胞株を用い,MAGE遺伝子の異なるExon間に設定したPrimerを用いて,RT-PCR法によりMAGE-1,2,3遺伝子の発現の検討を行った.次に肝癌組織切除術が施行された原発性肝癌症例を対象とし,腫瘍組織よりmRNAを抽出してβ-actinの発現を確認した後,MAGE-1,2,3遺伝子の発現を観察した. 肝臓由来細胞株では,MAGE-1,2,3は7種類のうちのそれぞれ4,4,3種類の細胞株でmRNAの発現を認めた.MAGE-1遺伝子の発現は肝細胞癌由来の細胞株に限ると4例中3例(75%)と高い発現率であった. 肝癌組織では,MAGE-1遺伝子は20症例中16症例(80%)において腫瘍部の組織でmRNAの発現が認められたのに対し,MAGE-2遺伝子の発現は12症例(60%),MAGE-3遺伝子の発現は,6症例(30%)で認められた。MAGE-2,3遺伝子のmRNAの発現が認められたものは,ほとんどの症例でMAGE-1遺伝子の発現も認められたが,径2cm以下の肝細胞癌2例においてMAGE-2遺伝子のみの発現が認められた。胆管細胞癌では腫瘍サイズがいずれも5cm以上と大きいにもかかわらずいずれのMAGE gene familyの発現は認められなかった.特異抗体を用いてペプチドの発現を検討したが,抗体の特異性の問題のためか明瞭には染色することができなかった. 現在,患者と同一のHLA抗原を有した細胞株,あるいはHLA遺伝子を導入してHLA抗原を発現させた細胞にMAGE遺伝子を導入してmRNAおよびペプチドを発現させ,患者から採取したTリンパ球をHLAをマッチさせたMAGE抗原陽性細胞をfeederとして培養して,これらのMAGE抗原発現細胞に特異的な細胞障害活性がみられるか否かを検討中である.細胞障害活性が確認できたら,これらのTリンパ球を増殖して患者の体内に戻すことで,MAGE抗原をターゲットとした免疫療法の臨床応用が可能になると思われる. 本研究で肝細胞癌に高頻度のMAGE gene familyの発現がみられることを確認できたことより,自己細胞障害性Tリンパ球を用いた癌特異的免疫療法の臨床応用の可能性を示唆するものと考えられた. 続きを見る
10.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 原発性胆汁性肝硬変の病因解析および治療法開発のための共同研究 — Identification and characterization of T cell epitope in primary biliary cirrhosis
中村 稔 ; NAKAMURA Minoru ; 石橋 大海
研究期間: 1999-2001
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概要: 【研究目的】PBCの病態形成に深く関わっていると考えられる抗ミトコンドリア抗体の対応抗原のT細胞のエピトープを同定し,抗原特異的T細胞による抗原認識様式を解析することより病因分子を明らかにし,この情報をもとに抗原特異的な免疫療法を開発する. 【研究方法・結果】PBC患者および健常者よりヒトPDC-E2 163-76ペプチド特異的T細胞クローンを樹立した.ヒトPDC-E2 163-176ペプチド上のT細胞エピトープと相同性を示す微生物等の外来抗原および自己抗原をコンピューターホモロジーサーチで検索し,合成ペプチドを作成した.T細胞クローンとこれらの合成ペプチドとの反応性を検討し,ペプチド間での交差反応性を解析した.その結果,PDC-E2 163-176反応性T細胞はPBCの病因と深く関係していることが推定される.興味あることにクローン化T細胞のTCRリガンドの認識は多様性に富むが,アナログペプチドとの反応からExDKとEIExDの2つのモチーフが同定された.さらに、それぞれのモチーフサーチにより,T細胞の中に複数の細菌由来のペプチドと反応するT細胞が存在していることが明らかになった. 【結論】T細胞のTCRリガンド認識における分子相同性機構が自己免疫疾患の発症や対応抗原の拡がりに関与している可能性が強く示唆された.今後、これらのPDC-E2 163-176反応性T細胞の役割および抗原特異的な免疫療法の開発に向けて,in vitroの胆管障害のアッセイ方法の確立やPBC動物モデルの開発,さらには免疫学的治療戦略として,自己抗原反応性T細胞のアナジーへの誘導,あるいはTh2タイプの細胞への誘導方法の開発が望まれる. 続きを見る