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1.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 有用ペプチド生産のためのプロテアーゼの形質変換
井本 泰治
研究期間: 1983
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2.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 前処理不要の低分子生体成分の直接分析用マイクロカプセル型カラム充填剤の試作
井本 泰治
研究期間: 1983-1984
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3.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 蛋白質の機能向上をめざしたリゾチ-ムの分子設計 — Molecular design of lysozyme for the improvement of protein function.
井本 泰治 ; IMOTO Taiji
研究期間: 1988-1989
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概要: 蛋白質工学によりニワトリリゾチ-ムの機能向上を目的に以下の研究を行った。1.開発済みの大腸菌によるニワトリリゾチ-ムの生産系を用いて、N末端にMetが付加し、さらに種々のアミノ酸残基の置換を施した変異リゾチ-ムを生産し、これらを活性構造に巻き戻した。2.この系で生産したリゾチ-ムのN末端は天然型と異なるため、これを天然型にするために、N末端にMet-Tyrが付加したリゾチ-ムから出発して試験管内でこれを切り落とす方法を確立した。3.酵母の発現分泌系の最適培養条件を確立し、それにより種々の変異リゾチ-ムを生産した。4.大腸菌、及び酵母の系を用いて生産した種々の変異リゾチ-ムの性質を検討した結果、以下の事がわかった。(1)触媒基であるGlu35とAsp52の置換体は、いずれもリゾチ-ム活性がほぼ消失した。(2)Asp52の置換体は、基質結合能が低下した。(3)35位に導入した解離性残基のpkはすべて異常となり、この部位に電荷をおくことは不都合であることがわかった。(4)Trp108をGlnで置換すると、活性は消失し、安定性も極めて低下した。(5)β-シ-ト上のAsn46をAspで置換すると、活性が約1/4に低下した。(6)37位および101位をGlyで置換すると、溶菌活性が上昇した。(7)14位と15位を共に欠失させた変異リゾチ-ムの熱安定性は低下したが、活性は向上した。(8)α-ラクトアルフミン様のカルシウム結合部位を構築したリゾチ-ムの還元状態からの巻戻しはカルシウム濃度で制御できた。5.一方、安定性及び活性の向上したリリゾチ-ムを生産するためには、どの様な変異を導入すればよいかを天然の変異に学ぶために、猪、豚、スナメリ(小型鯨)、犬及び、シロカン(鳥類)のリゾチ-ムを単離し、それらの一次構造と活性及び安定性を調べた。機能の向上に寄与していると考えられるアミノ酸置換を検索中である。 続きを見る
4.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of 変異体を用いたリゾチームの構造構築過程の解析
井本 泰治
研究期間: 1997
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概要: リゾチームが還元状態からどのような道筋で再生するかを変異体を用いて解析した。Trp62をGlyへ置換した変異体を用いて還元状態から再生実験を行った。野生体は再生反応を開始した後速やかに活性の発現が認められた。一方、変異体においては再生反応開始直後から約1分間活性を発現しなかったが、その後野生体に比べゆっくりした速度で再生した。そこで、野生体及び変異体を1分、3分、5分及び30分間再生反応した後、ヨード酢酸を用いて遊離のチオール基をトラップし、ゲルクロマトグラフィーを用いてどのような大きさの分子種が生成しているかを調べた。野生体に比べ変異体では、再生反応開始直後にサイズの大きな分子種のポピュレーションが明らかに増加していた。この結果から、Trp62をGlyに変えたことでリゾチーム内の単独で構造を形成し得るペプチドAsn59からMet105を含む領域の構造形成が遅くなっており、変性構造を持つ分子種のポピュレーションが増加していることがわかった。このことを明確にするために、上述したトラップ時間において得られた生成物をトリプシン消化し、逆相HPLCによりジスルフィド結合の形成を解析した。この変異体においてもジスルフィド結合の形成される順序は野生体と同一であったが、再生1分後のそれらの生成量は、野生型に比べ明らかに低下していた。以上の結果から、Trp62のGlyへの変異体において、再生初期の構造(おそらくペプチドAsn59からMet105を含む領域)形成が非常に遅くなったと結論した。即ち、リゾチームの還元状態からの再生過程において、まずペプチドAsn59からMet105領域が形成し、その後これ以外の領域が形成することが強く示唆された。 続きを見る
5.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of タンパク質工学の基盤確立のための多角的アプロ-チ — Multiple approaches for the establishment of the basis of Protein Engineering.
井本 泰治 ; IMOTO Taiji
研究期間: 1990-1991
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概要: タンパク質の構造と機能の解明、機能向上を目指したタンパク質工学の基盤を確立する目的で、互いに密な連絡を取りながら以下の研究を行った。 1.アミノ酸置換を主としたアプロ-チ:T4 endonuclease Vの基質認識部位におけるGlu23はグリコシラ-ゼ活性に関与する残基であることを示した(大塚)。H^+ATPaseの活性にはThr156が関与し、H^+輸送をγ subunitが行っていることを明らかにした(二井)。遺伝性NADHーシトクロムb_5還元酵素異常症について解析した(指吸)。リゾチ-ムの触媒活性に及ぼすTrp108の役割を明らかにした(井本)。 2、タンパク質発現系の構築によるアプロ-チ:血液凝固因子VIIのGalドメインからEGFドメインの間にウシ組織因子との結合部位の存在を示唆した(岩永)。Zn依存性中性プロテア-ゼの活性部位、反応機構を議論した(鶴)。リシルtRNA合成酵素とLーリジン及びATPの結合を解析した(外村)。 3、比較生化学的アプロ-チ:Lysylendopeptidaseの高い選択性にHis210が重要であることを示した(崎山)。ハブPLA_2の種々のアイソザイムのアミノ酸配列の比較から、機能発現と構造との関連を議論した(大野)。ヒトアルドラ-ゼのキメラタンパク質を調製し、触媒活性を詳しく議論した(堀)。タンパク質のモジュ-ル構造に着目し、トリオ-スリン酸イソメラ-ゼやRNaseの構造、機能及び進化を議論した(郷)。 4、化学修飾によるアプロ-チ:新規に開発した修飾剤をタンパク質に導入することによりRNaseT1及びTrypsinが安定化することを示した(山崎)。 5、NMR、X線結晶解析によるアプロ-チ:X線結晶解析からLー乳酸脱水素酵素におけるアロステリック現象を解明した(太田)。NMR及びDistance geometory法によりネオカルチノスタチンの高次構造を解明した(小林)。BowmanーBirk型のプロテア-ゼインヒビタ-とTrypsinとの複合体のX線構造解析からインヒビタ-の機能について議論した(芦田)。 続きを見る
6.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of カルシウム結合部位を導入したニワトリリゾチーム変異体を用いた再生初期構造の形成要因の解明
井本 泰治
研究期間: 1998
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概要: リゾチームと高次構造において高い相同性を持つα-ラクトアルブミン(LAと略す)のCa結合領域をリゾチームの82から92のループ領域にそっくり導入した変異体を調製し、そのリゾチーム変異体(CaBリゾチームと略す)の還元状態からの再生過程に及ぼすCaの影響を評価した。変異を施したCaBリゾチームのtransformantを酵母を用いて発現させ、カチオン交換樹脂を用いた精製により目的物を得た。このCaBリゾチームを一旦還元し、Ca非存在下(2mMEDTA存在下)とCa存在下(2mMCaCl存在下)で、メルカプトエタノール-酸化型グルタチオンの系で経時的な再生を追跡した。明らかにCa存在下では、再生速度が速いことから、Caが存在すると導入したCa結合部位が速やかに形成することがわかった。一方、CaBリゾチームは酵母より発現すると収率が悪いので、大腸菌を用いた発現を行い、効率的に変性還元CaBリゾチームを得るために、N末端にSerが付加するようにデザインした(Ser^<-1>リゾチーム)。CaB Ser^<-1>リゾチームの濃度依存性はCa非存在下(2mMEDTA存在下または2mMCa存在下)では、peudo野生型(Ser^<-1>リゾチーム)のそれに比べ、濃度上昇に伴って大きく低下した。しかし、100mMのCa存在下では、CaB Ser^<-1>リゾチームの再生収率は、peudo野生型のそれに比べ、濃度上昇に伴ってもあまり低下せず、効率的な再生が起こっていることがわかった。そこで、100μMのCaB Ser^<-1>リゾチーム濃度における再生収率を種々のCa濃度の下で行った結果、Ca濃度に対する再生収率はシグモイド曲線となり、その中点のCa濃度は約35mMであった。再生の初期段階で構造形成とアグリゲーションが競合することがしられていることから、この結果は、再生開始のごく初期の段階でリゾチームの82から92のループ領域がランダムとは異なる構造(しかし、遷移状態の構造よりは緩い)をとることを意味している。 続きを見る
7.
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Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ランダム変異を用いたリゾチームのフォルディング情報の解析
井本 泰治
研究期間: 1995
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概要: 蛋白質のフォルディングの情報を解読する目的で以下の実験を行った。 (1)巻き戻り現象を明確に把握するために、巻き戻しの基本的方法論を確立した。 (2)ランダム変異体を能率良く確実に選び出すために、ストレプトマイシン依存性の菌を用いて100%リゾチーム遺伝子が入った大腸菌のみをポジディイブ選択できる系を確立した。 (3)リゾチームをいくつかの領域に分けて平均1個の変異が入るようなランダムオリゴヌクレオチドを張り付けてランダム変異体を作製する。酵母の分泌系でリゾチームを分泌しないもをまずは選び出す。第一選択はリゾチーム活性による溶菌斑を示さないものを選ぶ。次いで少量培養後、ELISAでリゾチームが全く分泌されないものに絞り込む。この段階でDNA配列を解析する。さらにこのリゾチーム遺伝子を大腸菌の発現系に移して発現させ、巻き戻り効率を検討する。以上の解析系を確立した。 (4)リゾチームの約1/3の領域について5000個以上の変異体の選択を完了した。現在のところ目的の変異体としては、2個以上の変異が入ったものしか捕まっていない。単一変換体に戻して、これら1個ずつの変換の重要性を検討している。一方、巻き戻りに関して決定的と思われる変換を意図的に施して解析することにより、情報を増やす研究も強力に押し進めている。 続きを見る
8.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ランダム変異を用いたリゾチームのフォルディング情報の解析
井本 泰治
研究期間: 1996
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概要: 本研究は、ランダム変異リゾチームをスクリーニングし、蛋白質のフォルディングに関与している残基のマッピングを行うことで、高次構造又は2次構造のどの辺はどのような変換が可能か又は不可能かについての情報を蓄積することを目的としている。そのため、酵母から分泌できないリゾチームをランダムライブラリーからスクリーニングした。すなわち、既に確立しているストレプトマイシン依存性大腸菌を用いたクローニング方法と、活性及びELISAによるスクリーニング系により、活性及び分泌量の減少したものを選び出した。DNAシークエンスの結果、2変異体Asp18His/Leu25ArgおよびAla42Val/ser50Ile/leu56Glnが得られた。これらの変異体を既に開発済みの大腸菌の発現系で生産・単離し、尿素及びグリセロール存在下でin vitroでの巻き戻しを行い、陽イオン交換HPLCにより解析した結果、両変異体ともその変異が原因で不安定となったため酵母から分泌しなかったと考えられた。さらに、これらの変異体のそれぞれの1アミノ酸変異体を作製し同様な解析を行った。この結果、Leu25ArgとLeu56Glnがその不安定さに寄与していて、それ以外の変異は野生型と同様な傾向を示した。このように、多重変異体が得られた場合、それぞれの1アミノ酸変異体を作製し解析することは必要であると思われる。以後、さらにスクリーニングを続けていく予定である。 続きを見る
9.
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
Cover image of ペプチド・蛋白質性医薬品の不可逆反応への対応 — STRATEGY FOR DEPRESSION OF IRREVERSIBLE REACTIONS OF PEPTIDES OR PROTEINS AS MEDICINE
井本 泰治 ; IMOTO Taiji
研究期間: 1996-1997
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概要: 蛋白質は水溶液中において、未変性伏態と変性状態の平衡関係にある。不可逆反応は往々にして変性状態と共役しておこる。従って、蛋白質の不可逆反応への対応として、1、未変性状態を極力変性状態に片寄らせないようにすること、2、変性状態から不可逆反応を起こさないようにすることに大別できる。本研究では、ニワトリ卵白リゾチーム(以下リゾチーム)をモデル蛋白質として、蛋白質の不可逆反応への対応を検討し、以下の結果を得た。lに関しては、種々の添加剤(グリセロール、グルコース、ガラクトース、マンノース、トレハロース、スクロース、サルコシン)存在下で、リゾチームの変性温度(pH3)を示差走査微量熱量計を用いて測定した。その結果、いずれもリゾチームの熱安定性を向上させ、これらの添加剤の存在がリゾチームにおいて、未変性状態を変性状態へ片寄らせないためには有効であることがわかった。特に、15Mトレハロース存在下では、リゾチームの変性温度を12度も向上させた。また、ポリオール類のリゾチームの変性温度の向上の程度とそれらの部分モル圧縮率の大きさが正の相関をしていることが明らかとなった。2に関しては、トレハロース、スクロース、サルコシン存在下で、リゾチームの失活実験(pH6)を行った。これらの添加剤存在下では、リゾチーム変性温度付近(75度)では、長時間のインキュベーションに関わらず全く失活しなかった。一方、100度では、失活はするが、その程度は添加剤非共存下に較べて格段に抑制された。これらの原因は、添加剤がリゾチームの変性状態をコンパクトにし、分子間相互作用を抑制した結果であることを見いだした。また、これらの添加剤は、リゾチーム内のアミノ酸残基のデアミデーションやラセミぜーション等の化学反応を抑制することも示した。即ち、これらの添加剤は、蛋白質の不可逆反応を抑制する性質も持っていることがわかった。 続きを見る