RT-PCR法によるHGF-mRNAの定量と局在

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RT-PCR法によるHGF-mRNAの定量と局在

フォーマット:
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
責任表示:
和佐野 公二郎(九州大学・医学部・助教授)
本文言語:
日本語
研究期間:
1995
概要(最新報告):
ラット肝細胞成長因子(HGF)のcDNA塩基配列308-328と606-626に一致する上流、下流プライマーを設計、ラット肝よりオリゴdT精製したmRNAを鋳型にRT-PCR(逆転写-ポリメラ-セ鎖反応)を行い期待どうりの分子量318塩基対の産物を得た。PCR産物内部のEcoRI, Avall制限酵素切断解析により期待どうりの塩基対断片を得、PCRが正確にHGFの狙ったシークエンスを読んでいることを確認した。このPCR産物をpCR-scriptベクターに挿入、XL-1blueをtransformし、青白選択後、菌株を増殖、plasmidをSDS-NaOH-PEG法にて精製した。精製plasmidを煮沸変性後、上述のプライマーセットを用いPCRを行い挿入物の存在保持をアガロース泳動にて再確認した。pCR-scriptマルチクローニングサイト両端に組み込まれたBssHIIサイトを切断し、切断断片をさらにAvaIIで切断、インサートのさし込み方向を決定した。分析したすべてのコロニーにおいてインサートはすべて+-逆転して挿入されていた。次に、digoxygenin-UTP標識antisenseRNAを得るためベクター下流の5′末端突出させるHindIIIサイトを切断、上流のT3RNApolymerase promotorよりdig-UTPラベリングミックスを用いdigラベル-antisenseRNAを生成させた。フォルムアルデヒド変性アガロース泳動にて産物を確認した後、陽性ナイロン膜にスポットし抗dig-alkphase抗体染色、発色させ、digのさし込みを確認した。このdig-RNAプローブを用い周産期ラット肺から抽出したtotal RNAをノーザンブロットし、HGF-mRNAの定量を行った。その結果HGF-mRNAは生後21-28日に高い値で検出された。このデータはKagoshima等(Eur. J. Biochem210 : 375)の所見と良く一致した。生後の肺の組織改築が21日頃に終了するが、その後の1週間にHGFが多量に生成される可能性が示された事は肺におけるHGFの役割、または非肝臓性のHGFの機能を考えるうえで興味深い。今後は、このプローブを用いHGF産製細胞の同定のためにin situ hybridizarionを行っていく。 続きを見る
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