象牙質形成因子の遺伝子クローニング

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象牙質形成因子の遺伝子クローニング

フォーマット:
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
タイトル(他言語):
Molecular Cloning of Dentin Morphogenetic Protein
責任表示:
中島 美砂子(九州大学・歯学部・助手)
NAKASHIMA Misako(九州大学・歯学部・助手)
本文言語:
日本語
研究期間:
1995-1996
概要(最新報告):
今回の研究では、歯髄創傷時の治癒過程において、歯髄細胞が象牙芽細胞に分化し、修復象牙質を形成するメカニズムを解明すべく、「象牙質形成因子」の遺伝子のクローニングを試みた。象牙質形成因子は異所性の骨化を誘導するBMP活性を有し、TGF-βスーパーファミリーに属すると考えられる。したがって、3′末端部の約130のアミノ酸配列に類似が認められることを利用して、3′側24種類のプライマーを用いてPCRを行った。テンプレートとしては、4週令ラット切歯歯髄より分離したmRNAからSuperScript rcverse transcriptasaを用いて合成したfirst strand cDNAを用いた。アガロースゲル電気泳動を行い増幅されたDNA、サイズ280-300bpのバンドを切り出しDNAを精製し、TA cloning kit (Invitrogen)を用いて大腸菌に形質転換した。ホワイトコロニーを拾い上げ、96穴プレートに培養し、BMP-2、-4、-6および-7を含む混合プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、既知のBMPを含むコロニーを除外した。プラスミド精製を行い、Automatic Sequencer (Pharmacia)にてAutoCycle Sequencing法で350個のプラスミドの塩基配列を決定した。その結果、BMP-2、-4、-6および-7以外に、BMP-8、Inhibin-βB、GDF-1、-5、-6の塩基配列を持つクローンが得られた。また、ラットvgrと59%、Inhibin-βAと55%のアミノ酸配列の類似がみられる未知の遺伝子、DMP62およびDMP63が得られた。ノーザンブロット分析の結果、DMP63は歯髄および脳に強く発現していることが判明した。さらに5′RACEを行い、蛋白コード領域の全長遺伝子塩基配列を決定した。DMP63の活性部位のアミノ酸配列はヒトInhibin-βBと45%の相同性を有していた。in situ hybridizationではDMP63は象牙芽細胞層に局在性がみられ、象牙芽細胞分化との関連性が示唆された。 続きを見る
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