蛍光性ペプチド基質を用いたプロテアーゼ活性測定法の開発とその実用化

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蛍光性ペプチド基質を用いたプロテアーゼ活性測定法の開発とその実用化

フォーマット:
助成・補助金
Kyushu Univ. Production 九州大学成果文献
タイトル(他言語):
Development and Application of Fluorogenic Peptide Substrates for Determination fo Blood Clotting Proteases
責任表示:
岩永 貞昭(九州大学・理学部・教授)
IWANAGA Sadaaki(九州大学・理学部・教授)
本文言語:
日本語
研究期間:
1986-1987
概要(最新報告):
1977年, 本研究の代表者らが開発したペプチジルー4-メチルクマリンー7-アミド(MCA)は, 水解によって遊離する7-アミノー4-メチルクマリンを高感度に検出できる点, プロテアーゼの合成基質として非常に有用であり, 今日血中や生体組織由来のプロテアーゼに対する種々の特異的MCA基質として広く活用されている. 本研究では, 昨年度にひき続き凝固・キニン・補体系プロテアーゼに対して, 一層特異性の高い高感度基質を開発する目的で, P_1部位にArgをもフジ, トリ, テトラペプチドーMCAを, P_2, P_3部位のアミノ酸残基を系統的に置換しつつ, 計70種類合成し, それらの有効性を検討した. 各種のプロテアーゼは主にウシ血漿から精製・分離し, 高純度標品を使用した. その結果, ヒトXla因子の高感度MCA基質が開発された. すなわち, Xla因子はP_2部位にAlaをもつ基質に親和性の高いことが判明し, 特に有用と考えられる基質として, Boc-Glu(OBZI)-Ala-Arg-MCA(Kcat=46S^<-1>, Km=370μM, Kcat/Km=120,000M^<-1>・S^<-1>)を見い出した. この基質に対するXa因子, IXa因子, VIIa因子, 活性型プロティンC, XIIa因子, 血漿カリクレインの水解活性は非常に弱く, Xla因子に特異的であった. また, ヒトXla因子のMCA基質に対する特異性は, 天然基質に(IX因子)のそれとは異なり, トリプシンの特異性と類似することが明らかとなった. しかし, IXa因子とVIIa因子の特異的基質は上記の70種の中にも見い出すことが出来ず, 両者の天然基質であるXa因子の切断部位をもとに合成したBac-Val-Val-Arg-MCA基質もまったく水解しなかった. 現在, IXa因子とVIIa因子の特異基質については, X因子の切断されるペプチド配列を含む断片を調製し, それを用いて両セリンプロテアーゼの要求する最小構造単位を調べつつある. 続きを見る
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